Генетична основа різноманітності антитіл

Наш організм зустрічається з великою кількістю інфекційних збудників. Оскільки імунна система не може “знати”, який тип мікроорганізму в майбутньому потрапить в організм, вона мусить мати певний запас структурно різноманітних імунокомпетентних клітин, які могли б знищити будь-який мікроорганізм. Антитілопродукуючі клітини (плазмоцити) здатні продукувати біля 10 біліонів антитіл із особливою структурою. У зв’язку з тим, що кожне антитіло має унікальну амінокислотну послідовність, воно повинно бути кодованим іншим геном. Однак, гіпотеза “один ген – одне антитіло” не є коректною тому, що людина має від 50 000 до 100 000 генів. Проведені дослідження показують, що існують різні механізми, які відповідають за утворення різноманітних антитіл.

1. Множинні зародкові лінії імуноглобулінових генів. Молекулярно-генетичні дослідження (клонування та секвестрування ДНК) показали, що кожен важкий і легкий ланцюг імуноглобулінів може містити більше, ніж 80 різних V сегментів та 6 різних J сегментів, які локалізовані в зародковій лінії. Відомі також біля 30 сегментів регіону D важкого ланцюга.

2. Соматична рекомбінація (VDJ рекомбінація). У зв’язку з тим, що молекули імуноглобулінів формуються в процесі дозрівання В-лімфоцитів, специфічна комбінація V, J та D сегментів формується для важкого ланцюга окремо. Це супроводжується делецією ДНК-послідовностей, яка відокремлює поодинокі V, J та D сегменти перед процесом транскрипції мРНК. Процес делеції забезпечується також рекомбіназами (кодованими RAG1 та RAG2 генами), які забезпечують розпад двохспіральної ДНК на специфічні ДНК-послідовності, які розташовані на бокових частинах генів V та D сегментів. Після делеції ДНК лише один з V, J та D сегментів залишається неделетованим і приєднується за допомогою лігаз один до одного. Цей процес “cutting and pasting” є відомий як соматична рекомбінація, він є протилежним до рекомбінації зародкових ліній, яка характерна для мейозу. Соматична рекомбінація дає унікальний результат: незважаючи на те, що ДНК-композиція інших клітин організму є ідентичною, зрілі В-лімфоцити змінюються за час перебудови ДНК-послідовностей. Оскільки вони мають певну кількість комбінацій V, J та D сегментів, соматична рекомбінація може генерувати велике число різних типів молекул антитіл.

3. Об΄ єднання різноманітностей. У зв’язку з тим, що V, J та D сегменти є об’єднаними, образ цієї композиції відображається в місці їх прикріплення, а незначне число нуклеотидів може бути делетовано (ліквідовано) або вбудовано в об΄ єднану частину цього регіону. Це сприяє наявності багатьох варіацій в амінокислотній послідовності антитіл.

4. Соматична гіпермутація. Після стимуляції чужорідним антигеном В-лімфоцит підлягає “вторинній диференціації” – процесу, який характеризується соматичною гіпермутацією. Рівень мутацій генів, які кодують імуноглобуліни, збільшується приблизно до 10³. Ці процеси приводять до утворення мінорних варіацій в ДНК-послідовностях, які кодують імуноглобуліни та визначають їх пептид-зв΄ язуючі властивості. Соматичні гіпермутації V, J та D генів, які можуть формуватися в результаті можливих помилок при роботі ДНК-полімерази або через відсутність правильної репарації ДНК, продукують велику кількість різноманітних антитіл.

5. Множинні комбінації важких та легких ланцюгів. Встановлено, що випадкові комбінації різних видів важких та легких ланцюгів також можуть формувати імуноглобулінові молекули.

Реалізація кожного з вище вказаних механізмів приводить до появи різноманітних антитіл. Завдяки цим механізмам можлива продукція від 10¹⁰ до 10¹⁴ відмінних один від одного антитіл.

 

Головний комплекс гістосумісності (HLA)

Головний комплекс гістосумісності (HLA) – це група, яка складається з мінімум 80 генів, які знаходяться в 4-Mb регіоні короткого плеча 6 хромосоми. HLA складається з трьох частин або ділянок, які названі класами - I, II, III клас.

Головний комплекс гістосумісності є синонімом HLA –системи. HLA-система (human leukocyte antigen) - названа так тому, що антигени цієї системи вперше були відкриті на лейкоцитах. МНС або HLA - це визначення групи генів (у кількості біля 100), які знаходяться на короткому плечі 6-ої хромосоми. Термін HLA відображає той факт, що вперше ці молекули були виявлені на мембранах лейкоцитів. Однак, на теперішній час вони виявлені на мембранах багатьох інших клітин.

Визначення окремого HLA-антигену (наприклад, HLA-В12) включає три компоненти: 1) абревіатура всієї системи - HLA; 2) локус, який містить дану специфічність - В (відноситься до І класу HLA); 3) порядковий номер антигену - 12.

Молекули HLA І класу складаються з одного важкого глікопротеїнового ланцюга та одного легкого ланцюга, який носить назву - β 2-мікроглобуліну. Цей протеїн кодується геном, який розташованим на 15 хромосомі. Найбільш важливими локусами І класу є локуси А, В та С. Ступінь експресії молекул HLA цього класу різний та індивідуальний для кожної людини. Так, експресія молекул HLA-С в 10 разів менша, ніж експресія молекул HLA-A та HLA-B. Більшість з локусів А, В та С мають велику кількість алелей, в результаті чого формується велика різноманітність генів HLA I класу в різних індивідуумів. Клас I HLA має 1, 8 Mb і містить 20 генів, але інші гени в цьому регіоні є менш поліморфними, ніж А, В та С гени і відіграють менш значущу роль у розпізнаванні їх Т-клітинним рецептором. Молекули класу I HLA переважно формують комплекс з чужорідними пептидами, який розпізнається рецепторами на поверхні Т-цитотоксичних лімфоцитів. Презентація антигену в комплексі з молекулами HLA класу I є необхідною для відповіді Т-цитотоксичних лімфоцитів на віруси, гриби, внутрішньоклітинні збудники, пухлинні клітини тощо.

Доведено, що молекули HLA І класу присутні на всіх ядерних клітинах людського організму. Найменша їх експресія виявлена на клітинах трофобласту, рогівки, мозку, міокардіоцитах, скелетних м’язів, кісткової і хрящової тканини тощо.

Регіон HLA системи містить також різноманітні хибні гени (гени, які мають подібну ДНК-послідовність для кодування генів, але нездатні вступати в транскрипцію чи трансляцію).

Молекули HLA І класу людини приймають участь у презентації антигенів Т-лімфоцитам. Їх можна поділити на класичні - які належать до підкласу Ia (HLA-A, -B, -C) та некласичні, які належать до підкласу Ib (HLA-E, -F, -G та гени MICA і MICB). Експресія HLA-E та HLA-G присутня на клітинах плаценти зародкових тканин і є вирішальною щодо визначення імунологічних стосунків між матір΄ ю та плодом. Молекули HLA-G здатні оберігати тканини плода від агресивного впливу NK-клітин і Т-цитотоксичних лімфоцитів матері, гальмуючи активність цих клітин.

У той час, як молекули HLA I класу знайдені практично на всіх клітинах і можуть зв΄ язуватися з рецепторами на Т-цитотоксичних лімфоцитах, молекули HLA II класу знайдені тільки на поверхні антигенпрезентуючих клітин (В-лімфоцитів, макрофагів, дендритних клітин, клітин Лангерганса тощо). Молекули HLA ІІ класу при розвитку запального процесу під впливом певних цитокінів (наприклад, IFN-γ) можуть з'являтися на Т-лімфоцитах, ендотеліоцитах, клітинах щитоподібної, підшлункової залози. Молекули HLA II класу є гетеродимерами, які містять α - або β -ланцюг, кожен з яких кодується різними генами, які розташовані на 6 хромосомі. У додаток до генів, які кодують систему HLA ІІ класу (DP, DQ та DR), регіон II класу містить також гени LMP, TAP, DM та інші. Їх відкриття та вивчення функції дозволило отримати принципіально нові дані про механізми імунної відповіді та їх генетичний контроль.

Доведено, що першими в механізми процесінгу включаються антигени HLA локусу LMP (гени LMP2 LMP7), які регулюють розмір і специфічність пептидів антигену, приводячи їх у відповідність до зв’язуючих сайтів молекул HLA І класу. Молекули HLA І класу синтезуються в цитозолі клітини, де до появи відповідного пептиду знаходяться в зв’язку з тирозинкалретикуліновим комплексом. Транспортування пептидів на поверхню клітини відбувається за допомогою недавно відкритих «пептидних насосів» TAP: TAP1 та TAP2 (транспортери, асоційовані з процесингом антигенів).

Молекули HLA II класу є гетеродимерами і кодуються високо поліморфними генами, які розташовані на 6 хромосомі. Вони синтезуються в ендоплазматичному ретикулумі, звідки після тимчасового сполучення з третім інваріантним ланцюгом транспортуються в ендоцитарний компартмент, де зв’язуються з пептидом або, якщо цього не відбулося - деградують у лізосомах. Після зв’язку з пептидом, який замінює інваріантий ланцюг, молекули HLA ІІ класу переходять на клітинну мембрану. Процес заміни інваріантного ланцюгу на пептиди контролюють білки, які також кодуються молекулами HLA і називаються HLA-DM. Таким чином, недавно відкриті локуси HLA LMP, TAP, DM відіграють важливу роль у експресії молекул HLA на клітинах, приймаючи участь у розвитку імунної відповіді. Порушення їх функції призводить до формування деяких імунодефіцитних станів та онкологічних хвороб, в основі яких лежить втрата можливості експресії HLA на мембранах імунокомпетентних клітин та пухлинних клітинах.

Високий рівень поліморфізму генів є результатом природної селекції алельної різноманітності. Кожна HLA-алель кодується іншою незначно зміненою молекулою, яка здатна зв΄ язувати чужорідний пептид. Кожний із цих варіантів буде зв΄ язувати пептиди даного патогену ефективніше, ніж інші. У зв’язку з тим, що репертуар різних HLA молекул є відносно обмежений, афінітет зв΄ язування пептидів з HLA-молекулами зазвичай виявляється нижчим, ніж афінітет при зв΄ язуванні мікропептидів з відповідно підібраними Т-клітинними рецепторами. Особи, клітини яких експресують велику різноманітність молекул HLA, мають більше шансів ефективно відповідати на різні інфекції. Наприклад, якщо особа є гомозиготниою за локусами першого класу HLA (A, B або C), тоді на її клітинах будуть експресуватися тільки 3 молекули HLA І класу. У гетерозиготних осіб на клітинах будуть присутні 6 молекул HLA І класу. У цьому випадку активність імунної система буде значно вищою, а ризик розвитку різних захворювань буде значно менший. Висока ступінь поліморфізму в основній популяції збільшує шанси того, що окремі особи в популяції будуть гетерозиготами. Окрім цього, високий поліморфізм в популяції зменшує шанси інфекційного патогену щодо його поширення в популяції.

У деяких випадках алелі HLA відомі як продуценти білків, які виявили високу ефективність проти специфічних патогенів. Наприклад, HLA-B53 захищає від малярії, а HLA-DRB1*1302 - від гепатиту В. Ці алелі продукують HLA-молекули, які мають здатність до високоафінного зв΄ язування інфекційних атигенів.

Високий поліморфізм генів HLA ІІ класу збільшує здатність членів популяції та окремого індивідуума відповідати на різні патогени. Молекули HLA І і ІІ класів потребують цитотоксичного чи хелперного Т-клітинного рецептору на специфічних лімфоцитах. Необхідність презентації мікропептидів патогену Т-лімфоцитам при участі молекул HLA, називається HLA-рестрикцією (обмеженням). Однак, не всі компоненти імунної системи обмежені HLA. Наприклад, система комплементу, не вимагає прямої взаємодії з молекулами HLA. Активність натуральних кілерних клітин не залежить від HLA презентації. Ннавпаки, NК клітини можуть руйнувати вірусінфіковані та пухлинні клітини, які втратили свої HLA-молекули. Це важливо для організму тому, що такі HLA^--клітини не ідентифікуються іншими клітинами імунною стстеми.

Гени, які кодують імуноглобуліни, Т-клітинні рецептори та протеїни першого та другого класів HLA, мають подібні ДНК-послідовності та структуру. Так, вони є членами сім΄ ї генів, подібних до генів глобіну, генів кольорів, колагенових генів тощо. Імуноглобуліни та Т-клітинні рецептори є різними на різних клітинах в межах одного організму, але HLA-молекули відрізняються тільки на рівні організмів.

Регіон класу III HLA - системи має 680 kb, містить біля 36 генів. Однак, не всі ці гени задіяні в реалізації імунної відповіді. Найбільш відомими генами цього регіону є гени, які кодують синтез компонентів комплементу С2, С4 та фактору В. Окрім цього, гени HLA ІІІ класу кодують: потоонкоген Notch 4; 21-стероїдну гідроксилазу CYP 21B (приймає участь у синтезі гліко- і мінералокортикостероїдів); рецептор для продуктів гліколізації RAGE; транскрипційний фактор CREB-RP (cAMP-зв’язуючий); неклітинний матричний білок (тенасцин); сериново-треанінову ядерну кіназу RPL.

До важливих властивостей антигенів HLA, які були відкриті недавно відносяться:

1) Молекула HLA набуває стабільної форми і відповідної трьохмірної конфігурації тільки після того, як у зв’язуючий сайт її складки вбудовується пептид. Тільки після цього молекула HLA здатна мігрувати на поверхню клітини, де вона готова виконувати свої функції. Видалення пептиду з пептидозв’язуючої структури HLA порушує її трьохмірну конфігурацію та призводить до руйнування молекули.

2) Комплекс HLA+пептид надзвичайно стабільний, очищається і кристалізується в єдиній структурі та залишається на поверхні клітини протягом кількох тижнів, що дозволяє багатьом Т-лімфоцитам сканувати пептид, який презентується антигенпрезентуючими клітинами (АПК).

3) Кожний пептид зв’язується з інваріантною ділянкою, характерною для кожної з алелів молекули HLA, яка має певний мотив амінокислотних залишків, в результаті чого відбувається зв’язування. Таким чином, у зв’язок з конкретним пептидом втягуються конкретні ділянки антигену - алельні варіанти молекул HLA, що й відноситься до основ генетичного контролю імунної відповіді.

 

Основні функції HLA-системи:

1) Зв’язування та презентація антигенів певній субпопуляції Т-лімфоцитів (Т-цитотоксичним лімфоцитам – через молекули HLA І класу та Т-хелперам – через молекули HLA ІІ класу) з наступним визначенням типу імунної відповіді – клітинної або гуморальної.

2) Визначення HLA-комплекту конкретної особи, що забезпечує її імунологічну індивідуальність (це має вирішальне значення в трансплантології та репродуктології).

3) Ідентифікація окремих HLA-антигенів, які зв’язані з підвищеним ризиком розвитку певної хвороби з діагностичною та лікувальною метою.

Методи визначення HLA-антигенів:

1) Серологічне типування (реакція зв’язування специфічних антитіл з антигенами на поверхні клітин, найчастіше лімфоцитів) - для HLA І класу.

2) Клітинне типування (стимуляція проліферації лімфоцитів у змішаній культурі, в якій відсутні дані антигени) - для HLA ІІ класу.

3) Генетичне типування (аналіз поліморфізму на рівні ДНК: метод гібридизації, метод ланцюгової полімеразної реакції з врахуванням специфічних послідовностей нуклеотидів, метод секвестрування ДНК).