Молекулярно-ситовая хроматографияВоснове этого варианта хроматографии лежит принцип разделения смеси веществ по их молекулярным размерам или молекулярным массам. Его называют также гель-фильтрацией или гель-хроматографией. Метод широко используют для выделения и очистки биополимеров - белков, пептидов, поли- и олигосахаридов, нуклеиновых кислот и даже клеток, например, тромбоцитов. В качестве носителей в молекулярно-ситовой хроматографии используются различные гели с трехмерной сетчатой структурой - декстрановые (сефадекс), полиакриламидные (биогель Р), агарозные (сефароза) или на основе стирола и дивинилбензола, простые силикагели, а также пористые стеклянные гранулы. Все гели и стекла имеют поры строго определенных размеров, по возможности, не содержат ионогенных групп и не обладают химическим или биологическим сродством к анализируемым веществам. Гелями называют дисперсные системы с жидкой или газообразной дисперсионной средой, в которой частицы твердой дисперсной фазы связаны между собой молекулярными силами сцепления различной природы. Молекулярно-ситовая хроматография может быть выполнена в колоночном и тонкослойном вариантах. Преимущество отдают колоночному варианту. Если набухшие гранулы декстранового геля (сефадекса) поместить вместе с растворителем в вертикальную колонку и внести на поверхность смесь веществ, то разделение смеси веществ происходит за счет того, что в поры геля могут проникать только вещества, размеры молекул которых не превышают размеров пор. В результате диффузий (проникновения) внутрь пор геля молекулы меньшего размера элюируются с геля позже, чем более крупные молекулы, не проникающие в поры геля (рис.24.12).
Рис. 24.12. Схема опыта по молекулярно-ситовой хроматографии. (Показано более быстрое продвижение крупных молекул белка.) • - большие молекулы; О - поры геля; • - малые молекулы
Декстрановые и полиакриламидные гели широко используются для освобождения органических веществ, от ионов неорганических солей. Для обессоливания белков подбирают мелкопористые сефадексы. Высокомолекулярные вещества (ВМВ) (белки, полисахариды) не проникают в поры этих сефадексов, а неорганические соли, наоборот, проникают. При добавлении растворителя в колонку ВМВ выходят из нее первыми, а соли выходят из колонки значительно позже. Молекулярно-ситовая хроматография применяется и для определения молекулярных масс белков.
|
