Работа 3.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МОРКОВНОГО НАПИТКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ В НЕМ КАРОТИНОИДОВ

Задание: получить сокосодержащий морковный напиток; определить в нем содержание каратиноидов.Сравнить полученный данные с рекомендуемыми нормами суточного потребления данного микронутриента в 200 мл напитка. Сделать вывод о функциональности данного продукта.

Теоретическое введение

Витамины– это органические соединения, присутствующие в продуктах питания в ограниченных количествах и необходимые для нормального осуществления обмена веществ и поддержания жизненно важных функций всех органов и тканей.

Массовые обследования, проводимые Институтом питания РАМН, показали, что 80…90 % россиян имеют недостаток витамина С. У 40…80 % населения обнаруживается недостаточная обеспеченность витаминами В₁, В₂, В₆, фолиевой кислотой; более 40 % населения испытывают дефицит каротина. Дефицит фолиевой кислоты отмечается у 70…100 % беременных женщин.

Причины дефицита витаминов в рационе современного человека связывают с уменьшением общего количества потребляемой пищи, однообразием рациона, увеличением потребления рафинированных, высококалорийных, но бедных витаминами продуктов, интенсивной технологической переработкой пищевого сырья, консервированием и длительным хранением пищевых продуктов, повышенной потребностью в витаминах у детей в период роста, беременных и кормящих женщин, лиц, страдающих тяжелыми инфекционными и хроническими соматическими заболеваниями, или подвергающихся стрессовым воздействиям, принимающих противозачаточные гормональные средства или другое длительное медикаментозное лечение, приемом алкоголя, курением и т.д.

Витамины – минорные компоненты пищи. Они не обладают пластическими или энергетическими функциями, но без них не происходит ни одна биохимическая реакция. Многие витамины синтезируются микроорганизмами, однако они, тем не менее, относятся к незаменимым факторам питания и должны поступать с пищей в необходимом количестве. Суточные потребности человека в витаминах колеблются в широких диапазонах – от микрограмм (витамин В₁₂) до десятков миллиграмм (витамин С).

В настоящее время известны 13 витаминов, абсолютная необходимость которых для организма не вызывает сомнения. Каждый витамин обладает определенной, только ему присущей функцией. β -каротин является провитамином А и обладает антиоксидантными свойствами. 6 мкг β -каротина эквивалентны 1 мкг витамина А. Среднее потребление в разных странах 1, 8…5, 0 мг/сутки. Верхний допустимый уровень потребления не установлен. Физиологическая потребность для взрослых 5 мг/сутки.

Определение каротиноидов в морковном соке

Определение ведут по ГОСТ Р 54058-2010 «Продукты пищевые функциональные. Метод определения каротиноидов».Сущность метода основана на экстракции каротиноидов из пробы или осадка, предварительно полученного путем обработки пробы растворами Карреза I и Карреза II, последующей очистке выделенного препарата петролейным эфиром и спектрофотометрическим определением массовой концентрации или массовой доли каротиноидов. Доли отдельных каротиноидов (от общего содержания каротиноидов) определяют спектрофотометрическим измерением во фракциях, полученных в ходе хроматографического разделе­ния экстракта.

Реактивы и материалы:	Вода дистиллированная, ацетон, толуол, эфир петролейный, окись алюминия, цинк сернокислый 7-водный, натрий сернокислый, магний углекислый
Химическая посуда и оборудование:	Спектрофотометр, весы, дозатор, хромоторгафическая колонка, гомогенизатор, центрифуга, пробирки для центрифугирования, воронка делительная, колба мерная 100 см3, колба круглодонная, колба коническая с притертой пробкой, стекловата.

Приготовление раствора Карреза I. 15 г калия железистосинеродистого 3–водного вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения. Объем раствора в колбе доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора – не более 1 мес.

Приготовление раствора Карреза II. 30 г цинка сернокислого 7-водного вносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают до полного растворения. Объем раствора в колбе доводят дистиллированной водой до метки.Срок хранения раствора – не более 1 мес.

Приготовление элюента А. В подходящей стеклянной емкости смешивают петролейный эфир и толуол в объемном соотношении 4: 1.Срок хранения раствора – не более 1 мес.

Приготовление элюента Б. В подходящей стеклянной емкости смешивают петролейный эфир и толуол в объемном соотношении 2: 1.Срок хранения раствора – не более 1 мес.

Частичная деактивация окиси алюминия. В коническую колбу с притертой пробкой вносят 100 г активированной окиси алюминия. Добавляют 12 см³ дистиллированной воды, тщательно перемешивают путем энергичного встряхивания до получения тонкодисперсной суспензии. Колбу с деактивированной окисью алюминия плотно закрывают притертой пробкой.Срок хранения раствора – не более 1 мес.

Подготовка хроматографической колонки. 28…30 г деактивированной окиси алюминия, суспендируют в 30 см³ петролейного эфира. На дно хроматографической колонки помещают кусочек стекловаты. Колонку частично заполняют петролейным эфиром. В колонку медленно вносят суспензию окиси алюминия. После короткой выдержки в колонке должен сформироваться слой окиси алюминия высотой около 8 см. Избыточный объем петролейного эфира выпускают из колонки. Конечный уровень петролейного эфира должен быть незначительно выше поверхности слоя окиси алюминия. Для защиты разделяющего слоя в колонке от образования в нем воздушных пузырьков температуры эфира и окиси алюминия не должны существенно различаться.

Проведение определения. При проведении определения принимают во внимание, что каротиноиды чувствительны к световому и тепловому воздействиям. Определение проводят в месте, защищенном от прямого солнечного или ультрафиолетового излучения.При подготовке и проведении определения должны быть соблюдены следующие условия:

Ø температура окружающей среды от 10 ⁰С до 25 ⁰С включительно,

Ø относительная влажность воздуха от 40 % до 70 % включительно

 

Экстрагирование каротиноидов из проб растительного происхождения. Данный способ экстрагирования применяют для выделения каротиноидов из твердых, пюре– и пастообразных продуктов растительного происхождения без жировых и белковых ингредиентов.При необходимости пробу измельчают с помощью подходящего устройства. 2…5 г продукта помещают в стакан гомогенизатора. Добавляют 100 см³ ацетона и 0, 1 г магния углекислого, проводят гомогенизирование пробы в течение 5 мин. Пробу выдерживают для формирования осадка, надосадочную жидкость – экстракт – декантируют в делительную воронку вместимостью 250 см³. Осадок последовательно промывают тремя порциями ацетона по 25 см³. Надосадочные жидкости каждый раз удаляют с осадка и смешивают в делительной воронке с экстрактом, полученным в результате гомогенизирования анализируемой пробы. Общий экстракт в делительной воронке используют для очистки органической фазы с помощью петролейного эфира.

Экстрагирование каротиноидов из проб животного происхождения и жидких функциональных пищевых продуктов. Данный способ экстрагирования применяют для выделения каротиноидов из твердых, пюре и пастообразных функциональных пищевых продуктов животного происхождения, содержащих жировые и белковые ингредиенты, а также из жидких функциональных пищевых продуктов (например, безалкогольных напитков, сокосодержащих напитков, соков, морсов, нектаров, коктейлей и т.п.).При необходимости пробу мелко измельчают с помощью подходящего устройства и тщательно перемешивают. 5…50 г продукта вносят в пробирку для центрифугирования вместимостью от 60 до 100 см³, добавляют дистиллированную воду до объема 50 см³, тщательно перемешивают стеклянной палочкой. К пробе добавпяют по 1 см³ раствора Карреза I и Карреза II, перемешивают стеклянной палочкой, выдерживают 2 мин при комнатной температуре. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 5 мин.

Подготовка образца.

Получение морковного сока. Взять 0, 5 кг моркови, тщательно вымыть водой, очистить. Натереть на терке и в ручную выдавить сок в предварительно подготовленную емкость. Можно использовать электрическую соковыжималку. При анализе жидких продуктов в пробирку для центрифугирования вносят от 5 до 50 см³ пробы продукта. При необходимости объем пробы продукта в пробирке доводят дистиллированной водой до 50 см³. К жидкой пробе добавляют по 1 см³ раствора Карреза I и Карреза II, перемешивают стеклянной палочкой, выдерживают 2 мин при комнатной температуре. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 5 мин. После центрифугирования бесцветную надосадочную жидкость удаляют из пробирки. К осадку в пробирке добавляют 40 см³ ацетона, тщательно перемешивают содержимое стеклянной палочкой в течение 3 мин. Проводят центрифугирование экстракта в течение 5 мин. затем отделяют надосадочную жидкость и количественно переносят ее в делительную воронку вместимостью 250 см³. Осадок в пробирке последовательно промывают тремя порциями ацетона по 25 см³, каждый раз проводя центрифугирование для разделения осадка и экстракта. Фракции экстракта собирают в делительной воронке. Общий экстракт в делительной воронке используют для очистки органической фазы с помощью петролейного эфира.

Очистка экстракта. Для проведения очистки экстракта в делительную воронку добавляют 50 см³ петролейного эфира, содержимое воронки перемешивают и выдерживают в течение короткого времени для формирования верхнего слоя органической фазы. Из воронки удаляют водную фазу экстракта. В воронку вносят 50 см³ дистиллированной воды для промывания органической фазы. Содержимое воронки осторожно переме­шивают легким встряхиванием. После выдержки водную фазу удаляют из воронки.Органическую (петролейную) фазу количественно переносят из делительной воронки в пробирку для центрифугирования. В пробирку добавляют 2 г сернокислого натрия, содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой, затем проводят центрифугирование для отделения петролейной фазы от осадка. После центрифугирования петролейную фазу переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³. К осадку в пробирке для центрифугирования добавляют 30 см³ петролейного эфира, перемешивают стеклянной палочкой, повторно центрифугируют.Отделяют петролейную фракцию и добавляют ее к первой порции в мерной колбе. Объем экстракта в мерной колбе доводят до метки петролейным эфиром. Полученный экстракт используют для спектрофотометрического определения общих каротиноидов.

Спектрофотометрическое определение общих каротиноидов. Оптическую плотность экстракта измеряют при 450 нм в спектрофотометре в кювете из оптического стекла и длиной оптического пути 1 см. В качестве раствора сравнения используют петролейный эфир. Расчет массовой концентрации или массовой доли общих каротиноидов проводят по формуле (1) или (2).

Хроматографическое разделение фракций отдельных каротиноидов

Концентрирование экстракта. Экстракт переносят в круглодонную колбу ротационного вакуумного испарителя вместимостью 250 см³. Растворитель удаляют из экстракта при температуре 40 ⁰С. Остаток экстрактивных веществ в колбе растворяют в нескольких кубических сантиметрах петролейного эфира, затем количественно переносят в хроматографическую колонку. Для исключения потерь круглодонную колбу промывают 10 см³ петролейного эфира, затем также добавляют полученный остаточный экстракт в хроматографическую колонку.

Фракционирование каротиноидов. Для хроматографического разделения экстракта и получения фракций отдельных каротиноидов используют следующие элюенты:

для каротиновой фракции (фракция I) – петролейный эфир;

фракции криптоксантиновых эфиров (фракция II) – элюент А; фракции ксантофиловых эфиров (фракция III) – элюент Б; фракции остаточных каротиноидов (фракция IV) – ацетон.

Скорость элюирования фракции из колонки составляет 2 капли в секунду. Количество каротиноидов во фракциях зависит от их содержания в анализируемом продукте. При анализе продуктов растительного происхождения (фруктов, напитков на основе фруктового сырья) для получения 1-й и 11-й фракций требуется около 50 см³ элюента. При высоком содержании каротиноидов во фракции II требуется не более 100 см³ элюента А. Фракцию III получают при расходе от 80 до 100 см³ элюента Б. Для уменьшения общего объема элюента первые бесцветные порции раствора отбрасывают. Для обеспечения полного извлечения каждой фракции элюирование проводят до тех пор. пока элюат не станет бесцветным. Остаточные каротиноиды (фракция IV) элюируют из колонки ацетоном.

Спектрофотометрическое определение каротиноидов во фракциях Оптическую плотность фракций отдельных каротиноидов измеряют при 450 нм в спектрофотометре в кювете из оптическогостекла и длиной оптического пути 1 см. В качестве раствора сравнения используют петролейный эфир.

Определение добавок красителей. Общая массовая доля всех каротиноидов фракциях должна составлять не менее 90 % от общего содержания каротиноидов. Если массовая доля каротиноидов во фракциях менее указанного значения, то анализируемая проба может содержать добавленные красители, например биксин. На присутствие биксина указывает фракция красно-желтого цвета, которая остается в хроматографической колонке после элюирования последней фракции каротиноидов – фракции IV. Биксин может быть элюирован из колонки смесью, состоящей из четырех объемных частей ацетона и одной объемной части раствора аммиака.

Определение добавленных каротиноидов. Настоящий метод может быть использован для определения содержания каротиноидов. например провитамина А, добавленных в функциональный пищевой продукт. Однако в определении в качестве контроля используют параллельную пробу анализируемого пищевого продукта, которая не содержит искусственный провитамин А.

Расчет:

Массовую концентрацию каротиноидов С, мг/дм³ и отдельных каротиноидов во фракциях 1-1V рассчитывают по формуле

,

где 4, 00 – коэффициент пересчета оптической плотности;

А – измеренное значение оптической ппотности;

F – фактор разбавления (отношение объема экстракта в петролейном эфире, см³ или объемов различных фракций к объему продукта, взятому для анализа см³.

Массовую долю каротиноидов. X. мг/кг, в функциональных пищевых продуктах рассчитывают по формуле

,

где V – объем экстракта в петролейном эфире см³;

m – масса пробы продукта, г.