Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Ход работы. Реактивы 2,3,4 содержат готовые к использованию реагенты





Реактивы 2,3,4 содержат готовые к использованию реагенты. Хранить при t – 2-80С.

Содержимое пакета с натрием едким количественно перенести в колбу вместимостью 1л, растворить и довести до метки дистиллированной водой, свободной от карбонатов. Хранить при комнатной температуре.

А. Приготовление опытной пробы. В пробирку вносят 0,25 мл субстратного раствора для определения АсАТ (или АлАТ), нагревают при 370С в течение 5 минут, добавляют 0,05 мл сыворотки крови, инкубируют при 370С 60 минут. Затем добавляют 0,25 мл 2,4-ДНФГ и выдерживают 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 2,5 мл 0,4М раствора натрия едкого, перемешивают и через 10 минут фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против холостой пробы.

Б. Приготовление холостой пробы. Эту пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови добавляют 0,05 мл физиологического раствора.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика

В пробирки вносят растворы в соответствии с таблицей, затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 2,4-ДНФГ, тщательно перемешивают и через 20 минут (18-250С) вносят по 0,5 мл 0,4н NaOH.

 

№ п/п Стандартный р-р пирувата натрия Физиологич. раствор Субстратный раствор АлАТ/АсАТ Активность фермента (АсАТ, АлАТ)
мл мл мл ммоль/(ч*л) мккат/л
0,05 0,1 0,45 1,0 0,28
0,1 0,1 0,40 2,0 0,56
0,15 0,1 0,35 3,0 0,83
0,2 0,1 0,30 4,0 1,11
0,25 0,1 0,25 5,0 1,39
контроль 0,1 0,50    

 

Инкубирую при комнатной температуре 10 минут и затем фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля. На оси координат откладывают найденную величину оптической плотности, на оси абсцисс – активность фермента в ммоль/ч*л или в мккат/л («ммоль/ч*л» соответствует 0,278 «мккат/л»).

Калибровочная кривая до величины оптической плотности 0,3. При более высоких значениях оптической плотности сыворотку крови необходимо развести и повторить анализ. При расчете активности учесть степень разведения сыворотки (пропорциональность между степенью разведения и активностью фермента в разведенной сыворотке наблюдается не всегда).

 

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (активность фермента, моль/ч*л) и сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин.

 

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют и к какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?

2. Почему АлАТ и АсАТ называют индикаторными ферментами?

3. Назовите нормальные величины активности исследованных Вами ферментов?

 






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 216. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.02 сек.) русская версия | украинская версия