Цитогенетичний метод

В 1956 році Дж. Тійо і А. Леван запропонували нову методику вивчення каріотипу людини, також встановили кількість хромосом в каріотипі людини (рис.1. Каріотип людини).

Т. Касперсон (1969) розробив методику диференційного забарвлення хромосом, яка значно підвищила можливості, дозволила точно визначити гомологічні хромосоми та порушення структури хромосом - хромосомні аберації (рис.2. Сегментація хромосом людини).

Цитогенетичний метод включає:

а) каріотипування;

б) диференційне забарвлення;

в) визначення статевого хроматину (У–хроматину, Х–хроматину).

Цитогенетичний метод дозволяє встановити:

а) кількість хромосом у каріотипі;

б) генетичну стать організму;

в) наявність хромосомних аберацій та їх локалізацію.

Застосування цитогенетичного методу в МГК дає можливість своєчасно діагностувати хромосомну патологію та попереджувати народження дитини з хромосомними синдромами.

Методи гібридизації соматичних клітин.

В 60-х роках були розроблені методи, які дозволяли вирощувати клітини в штучних умовах – методи генетики соматичних клітин (ГСК). За допомогою таких методів вивчають спадковість та мінливість на культурах соматичних клітин, що компенсує неможливість застосування до людини гібридологічного аналізу.

Методи ГСК базуються на вирощуванні клітин людини в штучних умовах, що дозволяє аналізувати клітинні процеси (в тому числі, процеси обміну речовин), які генетично детерміновані, а значить вивчати генетичні закономірності організму.

Для генетичних досліджень використовують:

1) вирощування культури клітин;

2) клонування;

3) селекцію клітин;

4) гібридизацію клітин.

 

Рис.4. Схема гібридизації соматичних клітин з утворенням синкаріонів (гетерокаріонів).

 

Методи генетики соматичних клітин дозволяють:

– вивчати зчеплення генів та їх локалізацію в хромосомах;

– первинну дію та взаємодію генів;

– генетичну гетерогенність спадкової патології;

– діагностувати спадкову патологію в пренатальному періоді.

Молекулярно – генетичні методи: метод секвенирування, зворотної транскрипції ДНК, розмноження (клонування) окремих фрагментів ДНК шляхом включення їх в бактеріальні плазміди. Такі методи дозволяють:

– вивчати генетичний матеріал (послідовність генів в ДНК), визначати локалізацію порушень на молекулярному рівні (генні мутації);

– визначити нуклеотидну послідовність ДНК та генів;

– розмножувати структурні гени (клонування) шляхом включення в бактеріальну клітину;

– рекомбінувати молекули ДНК для одержання необхідних речовин (генна інженерія) на основі генів людини;

– визначати точну локалізацію генної мутації (ДНК–зонди).

Подальший розвиток дозволить розшифрувати послідовності нуклеотидів як структурних, так і регуляторних ділянок геному людини, а також в перспективі лікування генних хвороб на молекулярному рівні.

Біохімічні методи.

Біохімічні методи дозволяють діагностувати спадкові хвороби, обумовлені генними мутаціями, які виникають в результаті порушення обміну речовин, а також поліморфізму молекулярних хвороб.

Існує два напрямки:

1) вивчення продуктів обміну, які визначають мутаційний фермент (збільшення або зменшення концентрації певних продуктів обміну вказує на зміну активності ферменту, його мутації);

2) встановлення порушень транспортних білків, ферментів.

Біохімічну діагностику спадкових порушень проводять в 2 етапи.

На першому (просіючому) етапі відбирають експрес методами найбільш ймовірні випадки хвороб, на другому –– більш складними методами уточнюють діагноз. Для експрес – діагностики частіше використовують мікробіологічні тести.

Біохімічні методи використовують також в пренатальній або післяпологовій діагностиці моногенних хвороб, що дозволяє своєчасно виявити патологію та призначити специфічні медичні заходи (профілактичні або лікувальні)

Імуногенетичний (імунологічний) метод.

Метод вивчення генетичних закономірностей імунологічними реакціями (антиген –– антитіло) з утворенням комплексів.

Завдання: вивчення генетичної детермінованості та поліморфізму:

– генів імуноглобуліну;

– комплексу генів гістосумісності;

– системи HLA людини;

– поліморфізму еритроцитарних антигенів.

Для досліджень використовується:

– біологічна рідина (кров, слина, спинно – мозкова рідина) і тканини;

– культури клітин (HLA, залоз внутрішньої секреції, кісткового мозку).

Для встановлення відповідних генів визначають їх генетичні маркери (детермінанти) –– антигени.

Імуногенетичні методи важливі для рішення проблем трансплантації органів на тканини, для діагностики спадкової патології моногенних та мультифакторіальних хвороб; для виявлення генетичної схильності та резистентності до хвороб; для встановлення генетичних карт хромосом людини; кореляції між імунологічними маркерами і захворюваннями.

Пренатальна діагностика спадкової патології.

Розробка нових методів діагностики різних спадкових хвороб дозволила вивчення клітинного матеріалу організму в пренатальний період з метою ранньої діагностики та попередженню спадкової патології, особливо з тяжкими вадами розвитку.

Для одержання необхідного для аналізу матеріалу проводять амніоцентез, на 15 – 16 тижні вагітності беруть амніотичну рідину, яка має клітини плоду та містить продукти його життєдіяльності.

Одержаний матеріал досліджують різними методами:

– біохімічним;

– цитогенетичним;

– молекулярно – генетичним (ДНК – зонди);

– імунологічним.

– допомогою амніоцентезу можлива діагностика всіх хромосомних хвороб, близько 70 спадкових хвороб, порушень обміну речовин, резус та інші конфлікти за еритроцитарними антигенами.

– Для пренатальної діагностики можливе використання матеріалу біопсії ворсин хоріону, для забору крові проводять пункцію судин плоду, що дозволяє раніше діагностувати патологію.

– Методи фетоскопії, ультразвукові дослідження дозволяють визначити стать та значні вади розвитку безпосередньо на прийомі у лікаря.

Пренатальна діагностика назначається в таких випадках:

1) при наявності в родинах дітей з вродженими вадами розвитку; з рецесивними моногенними хворобами;

2) при наявності хромосомних транслокацій у батьків;

3) при наявності у одного з батьків домінантного захворювання;

4) при віці матері більш як 35 років;

5) при викиднях, які, можливо, пов’язані з несумісністю плода і матері за еритроцитарними антигенами (резус-конфлікт, конфлікт за системою АВО та ін.).

Застосування пренатальної діагностики значно зменшило народжуваність зі спадковими хворобами.

Медико – генетичне консультування

Так як для більшості спадкових хвороб ефективного лікування не знайдено, то головну роль треба відводити профілактиці. Медико-генетичне консультування (МГК) –– це один з видів спеціалізованої допомоги населенню, родинам, яка направлена на попередження народження дітей із спадковою патологією.

Розвиток МГК пов’язують з S.C. Read (1947), який сформував основні задачі МГК. Ще раніше С.Н. Давиденков (1934) проводив консультування хворих, родин із спадковими порушеннями нервової системи.

Завдання МГК –– складання генетичного прогнозу для родин, осіб з порушеннями фізичного, психічного, статевого розвитку.

 

За

 

Складання генетичного прогнозу включає три етапи:

1) Визначення ступеня генетичного ризику.

Генетичний ризик –– специфічна ймовірність (від 0 до 1, 0) появи певної аномалії у пробанда або його родичів. Генетичний ризик може бути загальнопопуляційним (3–5%) та специфічним (0–100%).

Специфічний ризик може бути:

– низький (3–5%);

– підвищений (до 10%);

– середній (до 20%);

– високий (більше 20%).

Ступінь генетичного ризику залежить від типу успадкування ознаки, спорідненості особин у шлюбі, наявності у батьків транслокацій.

2) Оцінка тяжкості медичних та соціальних наслідків даної аномалії.

Ступінь генетичного ризику іноді не співпадає зі ступенем патології. Наприклад, А––Д полідактилія передається з ймовірністю 50%, але можлива корегуюча операція, після якої хворий може вести нормальний спосіб життя. Ризик менінгомієлоцеле для сибсів становить 3–4%, але наслідки хірургічної операції не завжди позитивні, часто після операцій можливий парапарез нижніх кінцівок, розумова відсталість. Ступінь медичних та соціальних наслідків у другому випадку тяжка.

3) Перспектива застосування та ефективність методів пренатальної діагностики.

Застосування методів пренатальної діагностики дозволяє планувати дітонародження в родинах високого ризику, попередити народження дітей з вродженою патологією.

Зміст роботи генетичної консультації визначається її кінцевою метою, тобто встановленням ступеня генетичного ризику в обстежуваній родині, і роз'ясненням у доступній формі змісту медико-генетичного висновку тим хто звернувся.

Точність прогнозу залежить від наступних факторів:

1) точності клініко-генетичного діагнозу,

2) старанності й об'єктивності генеалогічного дослідження,

3) знань новітніх даних генетичної літератури.

Точність клініко-генетичного діагнозу — це першочергова проблема сучасної генетичної консультації, тому що в даний час у більш ніж 75% обстежених родин мова йде про ізольований прояв вродженої аномалії в родині і діагноз у такому випадку є вихідним пунктом для складання генетичного прогнозу. Завдяки систематичному проведенню санітарно-просвітньої роботи серед населення і популяризації медико-біологічних знань батьки або інші родичі звертаються в генетичну консультацію вже при народженні першого ураженого аномалією індивідуума. Родовід, у якому спостерігається ідентичне ураження членів родини, є рідкістю.

Правильний клініко-генетичний діагноз забезпечується в практиці генетичної консультації проведенням ряду спеціальних досліджень: цитогенетического дослідження (для підтвердження або виключення хромосомних аберацій у випадку диференціальної діагностики для уточнення характеру хромосомних аберацій (ХА) при визначенні співвідношень розщеплення); вивчення дерматогліфіки, що, правда, менш специфічна, але може, служити важливим діагностичним критерієм при розпізнаванні ряду вроджених аномалій та вад (синдром Дауна, синдром Сотоса, артрогрипози і т.д.) і соматогенетичного дослідження із синдромологічним аналізом, значення якого значно зросло останнім часом.

Необхідною умовою точного клініко-генетичного діагнозу, а також успішної пренатальної діагностики при подальшому відтворенні родини хворого є створення довгострокової тканинної культури фібробластів. Точний клініко-генетичний діагноз дозволяє не тільки встановити ступінь генетичного ризику (при трисомії і транслокаційній формі хвороби Дауна, мукополісахаридозі I Гурлер і мукополісахаридозі II Хантера), але й здійснити вибір ефективних методів пренатальної діагностики (при вроджених метаболічних аномаліях необхідно знати тип і ступінь ферментного дефекту в хворого, наприклад, диференціальний діагноз між синдромом Салдино - Нунана й іншими типами хондродистрофій немовляти є необхідною передумовою для обґрунтування показань до застосування єдиного ефективного методу пренатальної діагностики — фетоскопії).

Генеалогічне дослідження - це основний метод у практиці генетичної консультації, вихідний пункт генетичного аналізу.

Потрібно, щоб генетичний анамнез був повним і об'єктивно підтверджений медичною документацією, що відноситься до особистості пробанда і його родичів. У зв'язку з цим збирати інформацію треба дуже ретельно, виявляючи при цьому належний такт і делікатність при встановленні необхідних контактів з родиною; більшість даних слід повторно перевіряти і доповнювати при зустрічах із членами родини. Генеалогічні дані збираються в консультації звичайно до коефіцієнта споріднення з пробандом r = 1/8, тобто до прабатьків по висхідній лінії і до двоюрідних сибсів з бічної. Зовсім необхідно, щоб дані були отримані від усіх членів родини, здорових і уражених, включаючи також і рано померлих (перинатальна смерть або смерть у ранньому дитячому віці), з урахуванням послідовності їхнього народження. Звертається увага на родинні шлюби, позашлюбні зв'язки, повторні шлюби і багатоплідні вагітності.

При складанні родоводу варто фіксувати вік окремих членів родини, відзначати терміни маніфестації (фенотипового прояву) патологічних ознак, народження дітей, а при необхідності - і смерті. Інформація про предків значною мірою визначає генетичний прогноз, що ґрунтується на співвідношеннях розщеплення й емпіричних даних.

Генеалогічне дослідження може виявити знижену пенетрантність чи експресивність патологічного гена, антиципацію спадкоємної аномалії в поколіннях або її акцентуації і різні інші впливи, що можуть підвищувати або знижувати ступінь генетичного ризику. Крім того, можна виявити членів родини, яким загрожує потенційна небезпека успадкуавння захворювання.

Активна диспансеризація хворих може врятувати чи продовжити їхнє життя (поліпоз кишечнику, гіперліпопротеінемія II типу й ін.). Знайомство з новітніми даними генетичної літератури необхідно як для діагностики (щорічно учені відкривають декілька сотень генетично обумовлених аномалій), так і для вибору найбільш сучасних і раціональних шляхів і методів профілактики і пренатальної діагностики.

Співробітництво генетичної консультації з представниками інших спеціальностей: біохіміками, гематологами, імунологами, лікарями клінічних спеціальностей - педіатрами, невропатологами, офтальмологами, отоларингологами, хірургами, гастроентерологами, гінекологами, а також патологоанатомами - є цілком природним у системі діагностичних, лікувальних і профілактичних клініко-генетичних заходів.

Деякі спеціалізовані види досліджень, наприклад энзимологічні, біо-, гістохімічні на рівні тканинних культур, для клінічної (у тому числі і пренатальної) діагностики здійснюються в співробітництві з національними і міжнародними центрами, оскільки діагностика ряду вроджених метаболічних аномалій надзвичайно складна і вимагає спеціалізованих центрів, укомплектованих відповідним обладнанням і висококваліфікованими кадрами. Частота окремих метаболічних аномалій відносно невисока, так що один такий спеціалізований центр може обслуговувати досить велику територію. У генетичній консультації працюють клінічні генетики (лікарі), цитогенетики (лікарі або біологи), медичні сестри і референти з соціальних питань.

Генетичний ризик - специфічна ймовірність прояви визначеної аномалії у пробанда і його родичів. Відсутність специфічного ризику не є результатом генетичного дослідження. Він має місце, наприклад, для дітей здорового сибса хондродистрофіка чи пробанда, ураженого іншою аутосомною аномалією, яка успадковується за домінантним типом (рис. 1 а); для нащадка батьків, уражених аутосомними гетероалельними аномаліями, які успадковуються за рецесивним типом, як показано на рис. 1 б, де в родині чоловіка проявилася аутосомно-рецесивна глухонімота, а в родині (рис. 1б) дружини глухонімота зчеплена з пігментною ретинопатією (синдром Ушера); для дітей здорового брата хворого на гемофілією; хворого іншою аномалією, зчепленою з Х-хромосомою, яка успадковується за рецесивним типом (рис. 1 в); для потомства жінки, напівсибси (брати по одному батьку), якої страждають міопатією Дюшенна (рис. 1 г); для нащадків здорової сестри жінки, у якої народилася дитина із синдромом Апера(рис. 1 д), що є результатом нової генної мутації (мутації de novo).

 

Рис. 1. Приклади родоводів з нульовим специфічним ризиком.

 

 

Таблиця 1. Генетичний ризик для сибсів при різних типах передачі захворювання

Тип спадкової передачі аномалії	Генетичний ризик для сибсів (%)
Домінантна генна мутація de novo Хромосомна мутація de novo Аутосомно-рецесивний тип Гоносомно-рецесивний тип   Аутосомно-домінантний тип з неповної пенетрантністю Полігенно детермінований тип Фенокопія   Незбалансована хромосомна аберація в результаті наявності в одного з батьків	для сестер 0 для братів 33-50 35-50 до 10 загально–популяційний ризик   5-90

Рис. 2. Оцінка ризику при спорідненому шлюбі.

Ймовірність гетерозиготного носійства: ІІ/4 ═ 2, 3; І/2 ═ 1; 1/3 ═ І/2; ІІ/5 ═ 1/4; імовірність гетерозиготного носійства: ІІІ/2 ═ 2, 3; ІІ/2 ═ 1; ІІ/3 ═ І/2.

Ризик для дітей ІІ/4 і ІІ/5 ═ 2/3 х 1/4 х 1/4 ═ 2/48 (4%).

Ризик для дітей ІІІ/2 і ІІ/3; 2/3 х 1/2 х 1/4 ═ 2/24 (≈ 8 %).

 

 

Розглянемо (рис. 3) визначення специфічного ризику та прогнозу у випадках менделюючих ознак на нижче наведених прикладах.

Рис.3. Особливості прогнозу потомства при менделюючих аномаліях.

К – людина (пробанд), яка консультується.

а) Неточний діагноз пробанда.

У консультацію була направлена родина, друга дитина в якої від 3-й вагітності вмерла незабаром після пологів, будучи уражена палатосхизисом і менінгоцеле окципітальної області. Мати знову була вагітна. Генетичний ризик маніфестації менінгоцеле був би невеликим (близько 4%), і для його виключення можна було б застосувати метод пренатальної діагностики у вигляді визначення рівня альфа-1-фетопротеїна в навколоплідних водах, якби ми були упевнені в цьому діагнозі.

З огляду, на не зовсім звичайну локалізацію розщеплення невральної трубки, дані попередньої вагітності, що закінчилася викиднем, а також результатами розтину, що показало наявність полікістозу нирок, в МГК запідозрили синдром Мекеля, який успадковується аутосомно-рецессивно та характеризується 25 % ризиком повторення для сибсів, і родина, таким чином, відмовилася від перспективи мати ще одну дитину (це рішення полегшувалося тим, що родина вже мала одну здорову дитину).

б) Гетерогенність.

Двоє здорових молодих людей, наречений і наречена, звернулися в генетичну консультацію в зв'язку з виявленням в обох родинах аномалій слуху, у нареченого були глухі брат, дядько з боку матері і племінник (син сестри), а наречена мала глухих брата і сестру, її батьки мали нормальний слух.

Ймовірність прояву глухоти у майбутніх дітей пробанда практично дорівнює нулю, тому що аномалія в родині нареченого зчеплена зі статтю і передається по Х-рецесивному типу, а в родині нареченої аномалія є аутосомно-рецессивною. Мова йде про незчеплені неалельні гени (гетерогенність), і специфічний ризик, отже, дорівнює 0%.

в) Знижена експресивність.

Фенотипово здорова жінка (пробанд), батько, дядько і сестра якої страждають недосконалим остеогенезом, цікавилася генетичним прогнозом для своїх дітей. У пробанда знайшли лише блакить склер. Було встановлено також, що пробанд не мала переломів, мала гарний слух. Експресивність гена в неї знижена приблизно до 80%. Ймовірність того, що вона є носієм патологічних генів, які у неї маніфестувалися тільки блакиттю склер, дорівнює 80%, а ймовірність, що її діти можуть бути уражені остеопорозом, дорівнює 4/5 х 1/2=4/10, тобто 40%.

г) Пізня маніфестація аномалії.

У консультацію звернулася 50-літня жінка, мати в якої вмерла в 54 роки від хвороби Гіппеля - Ліндау, що проявилася в одного брата жінки в 32-літньому віці нирковою недостатністю, а в іншого в 29 років - сліпотою. Пробанд маючи 2 дочок 25 років і 21 року, цікавилася прогнозом для їхніх дітей.

Апріорна ймовірність захворювання для неї складає 0, 5;

умовна ймовірність (P^U/H)=0, 1;

апостеріорна ймовірність

(P^H/U)= (0, 1 х 0, 5): (0, 1 х 0, 5 + 0, 9 х 1) = 0, 052.

Таким чином, ймовірність того, що ІІ₂ гетерозиготна при умові, що ознаки хвороби ще не проявилися до 50 років, знизилася з 50% до 5, 2%, і ризик для її дочок складає 2, 6%, а для дітей дочок - 1, 3%. Така ймовірність не може бути протипоказанням для подальшого дітонародження в родині пробанда та її дочок.

д) Зчеплення генів.

Вагітна жінка звернулася в консультацію, 2 її брати страждали ядерною катарактою (із приводу якої був прооперований і їхній дядько з боку матері), вона просила визначити стать свого плоду. За літературними даними аномалія зчеплена з статевою хромосомою (Х-зчеплена рецесивна), а патологічний ген знаходиться в тісному зв'язку з геном групи крові Xg.

Обоє уражених брати мають генотип Xg⁺, у той час як пробанд мала генотип Xg ^-, як і її батько. Генотип її матері Xg⁺Xg^-, причому відомо, що в родині ген ядерної катаракти локалізується на Х-хромосомі разом з геном групи крові Xg⁺. Жінка - пробанд не одержала цю хромосому від матері (зв'язок дуже тісний, 1% кросинговеру), і, таким чином, не треба рекомендувати вагітній жінці пренатальне визначення статі плоду.

е)Вірогідність тестів на гетерозиготність гоносомно-рецесивних захворювань.

При деяких таких захворюваннях встановлення гетерозиготності спеціальними тестами має 100% вірогідність (наприклад, для синдрому Леша-Нигана, синдрому Хантера). Вважається, що до 30% жінок носіїв патологічних генів не виявляється.

На рис. 3 е) представлений родовід жінки, що звернулася в консультацію. Вона має брата, хворого міопатією Дюшена. Апріорна ймовірність, що вона гетерозиготна - 0, 33. Після визначення рівня креатинфосфокінази, який у неї був не підвищеним, умовна ймовірність становить:

(P^U/H) = 0, 03.

Апостеріорна ймовірність гетерозиготності ІІ₂ знижується.

(P^H/U) = (0, 33 х 0, 3): (0, 33 х 0, 3 + 0, 66 х 1) = 0, 099: (0, 099+0, 66) = 0, 013 або (13%)

Таким чином, ймовірність для жінки, якщо вона гетерозиготна, знизилася з 33% до 13%. Ризик успадкувати міопатію для її дітей становить - 13% х 1/4=3, 25% (для синів - 6, 5%). У зв'язку з тим, що жінка спостерігала важку картину захворювання у брата, вона зважилася на пренатальну діагностику статі плоду.

На прийняття позитивного рішення впливають наступні фактори:

1) можливості наступної медичної корекції даного дефекту або його часткового виправлення;

2) дефект (аномалія) не обмежує нормальний спосіб життя хворого;

3) пізня маніфестація дефекту;

4) відсутність дітей у родині;

5) перінатальна летальність розглянутого дефекту.

Фактори, що негативно впливають на рішення родини:

1) відсутність або обмеженість можливостей проведення пренатальної діагностики;

2) психічне захворювання пробанда і його присутність у родині;

3) тривале проживання хворого в родині, що накладає значні соціальні обмеження;

3) наявність здорових живих дітей в родині.

6. МАТЕРІАЛЬНЕ І МЕТОДИЧНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ

учбові таблиці; методичні вказівки; збірники задач.

 

ПРАКТИЧНЕ ЗАНЯТТЯ № 17

ТЕМА

Цитогенетичний, гібридизації соматичних клітин, ДНК – аналіз, генетична інженерія, біохімічний і імунологічний методи, значення їх для діагностики молекулярних хвороб. Пренатальна діагностика. Основи медико-генетичного консультування.