Уравнение Михаэлиса-МентенВажнейшим фактором, определяющим скорость ферментативной реакции, является концентрация реагирующих веществ, концентрация субстратов. Как было указано выше, фермент взаимодействует с субстратом с образованием фермент-субстратного комплекса. Затем фермент-субстратный комплекс распадается с образованием продукта реакции, а катализатор остается в исходном состоянии. Ниже приведено уравнение, отражающее процесс ферментативного катализа с образованием продукта реакции:
Как видно из этого уравнения, фермент Е взаимодействует с субстратом S с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Этот процесс характеризуется константой скорости – k 1. Комплекс ES способен распадаться на исходные компоненты – Е и S с константой скорости k− 1. Константа k2 представляет собой константу скорости распада комплекса ES с образованием продукта реакции. Вполне очевидно, что фермент-субстратный комплекс способен к обратимой диссоциации в соответствии с уравнением:
Исходя из закона действующих масс, скорость образования комплекса ES можно записать следующим образом:
где k 1 – константа скорости реакции образования комплекса ES. Поскольку комплекс ES способен диссоциировать без образования продукта реакции скорость распада комплекса ES можно выразить уравнением:
где k− 1 – константа скорости реакции распада комплекса ES. При равенстве скоростей V 1 и V 2 получим выражение:
Разделив обе части уравнения на величину k1, получим: [ E ][ S ] = k− 1 / k1 [ ES ], где k− 1 / k1 представляет собой величину называемую константой диссоциации – K S.
После соответствующего преобразования выражение приобретает вид:
В последнем уравнении величину [ E ] можно представить как [ E 0]–[ ES ], что представляет собой концентрацию свободного фермента за вычетом концентрации фермента, связанного с субстратом [ ES ]. Величина [ E 0] – общая концентрация фермента в начале реакции. Подставив в предыдущее уравнение вместо [ E ] – [ E 0]–[ ES ] получим:
После преобразования последнего уравнения получаем:
Максимальная скорость ферментативной реакции достигается в ситуации, когда концентрация комплекса ES равна начальной концентрации фермента Е 0 т.е. [ ES ] = [ E 0]. Таким образом, можно записать следующее выражение:
Поскольку из предыдущего выражения следует, что:
то получаем:
Последнее уравнение получило название уравнения Михаэлиса-Ментен. Графически зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции отображает рис. 6.1. Из этого рисунка видно, что при низких концентрациях субстрата реакция характеризуется первым порядком, а при его высоких концентрациях становится реакцией нулевого порядка, когда скорость реакции становится постоянной величиной. Следует, однако, помнить, что уравнение Михаэлиса-Ментен справедливо только для начального времени реакции, когда присутствует избыток субстрата и образуется небольшое количество продукта. Именно поэтому уравнение Михаэлиса-Ментен носит несколько ограниченный характер, поскольку оно учитывает только первую часть процесса и не учитывает его вторую стадию – влияние продукта реакции и его взаимодействие с ферментом. В связи с этим Холдейном и Бриггсом было предложено усовершенствованное выражение уравнения Михаэлиса-Ментен:
где КM – константа Михаэлиса, которая равна концентрации субстрата (выраженной в молях/литр), при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. Численное значение константы Михаэлиса может быть выражено следующим образом:
Преобразованное Холдейном и Бриггсом уравнение Михаэлиса-Ментен, которое имеет вид
описывает поведение многих ферментов при изменении концентрации их субстратов. Используя это уравнение можно рассмотреть несколько ситуаций, отражающих влияние [ S ] и КM на начальную скорость ферментативной реакции:
1. Значение [ S ]намногоменьше величины КM (рис. 6.1). В этом случае величину [ S ] в знаменателе можно опустить, и он будет практически равен величине КM. Отношение двух постоянных величин – V max и КM, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:
(@ означает «примерно равно»). Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже величины КM – начальная скорость реакции, V 0, пропорциональна концентрации субстрата [ S ];
2. Значение [ S ]намногобольше величины КM (рис. 6.1). Тогда величиной КM в знаменателе можно пренебречь, т.е.
Это означает, что при концентрации субстрата [ S ], намного превышающей КM, начальная скорость V 0 равна максимальной скорости – V max;
3. Наконец, при равенстве величин [ S ] и КM (рис. 6.1) в знаменателе уравнения Михаэлиса-Ментен получим удвоенное значение [ S ].
Это означает, что при концентрации субстрата, равной КM, начальная скорость реакции V 0 составляет половину максимальной скорости – V max.
Графическое определение константы Михаэлиса (К m)
Графически константа Михаэлиса может быть представлена, как это показано на рис. 6.1. Однако в случае многих ферментов определение V max и КM непосредственно из графика зависимости V 0 от [ S ] (рис. 6.1) оказывается затруднено. Для большего удобства уравнение Михаэлиса-Ментен было преобразовано Лайнуивером и Берком в координатах двойных обратных величин:
Правую часть уравнения представляют в виде суммы двух слагаемых:
Упростив уравнение, получаем:
Как можно видеть, это уравнение представляет собой уравнение прямой:
у = ах + b, где у = 1/ V 0 и х = 1/[ S ]. Если построить график зависимости у (т.е. 1/ V 0) от х (т.е. 1/[ S ]), то длина отрезка b, отсекаемого на оси у, будет равна 1/ V max, а тангенс угла наклона – а равен величине KM / V max. Длину отрезка, отсекаемого на оси х (в области отрицательных значений), можно получить, приравняв к нулю. Тогда получим:
График уравнения Михаэлиса-Ментен в обратных координатах называют графиком Лайнуивера-Берка (рис. 6.2). Используя его, величину KM можно определить либо по наклону прямой и длине отрезка, отсекаемого на оси у, либо по длине отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений на оси х. Поскольку [ S ] измеряют в молях/литр, KM имеет ту же размерность. Скорость V 0 может быть выражена в любых единицах, поскольку KM не зависит от [ E ]. ГрафикЛайнуивера-Берка позволяет определять KM по относительно небольшому числу точек, поэтому он часто используется для расчета этого параметра.
Используя график Лайнуивера-Берка на практике, при определении KM, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких концентраций субстрата. Это происходит в тех случаях, когда измерения проводят через равные интервалы [ S ]. Чтобы этого избежать, измерения следует проводить при таких значениях [ S ], которые соответствуют равным интервалам на оси х в обратных величинах. Еще одним вариантом линеаризации зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата является преобразование Хейнса-Вулфа. Если в уравнении Михаэлиса-Ментен в обратных координатах
обе части умножить на величину [ S ], получим:
или
График зависимости [ S ]/ V 0) от [ S ] (рис. 6.3) представляет собой прямую линию, где тангенс угла наклона равен величине 1/ V max, длина отрезка, отсекаемого на оси у, будет равна KM / V max, а отрезок, отсекаемый на оси х, равен величине – KM. Определение KM имеет большую практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих KM, фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максимальная скорость, V max, будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это немаловажное обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Знание величины KM позволяет определить, какое количество субстрата следует внести в реакционную смесь для определения V max. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое применение также при анализе характера действия ингибиторов в ферментативных реакциях.
|
,
,
или 
,
; 
; 
; 
