Студопедия — Приготовление реактива Эллмана
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Приготовление реактива Эллмана






1. Для получения 10 мМ раствора реактива Эллмана 37 мг 5, 5'-дитиобис[2-нитробензойной] кислоты растворяют в 10 мл 0, 1 М калий-фосфатного буфера рН 7, 0. Перемешивают до полного растворения.

2. В полученный раствор добавляют 15 мг бикарбоната натрия и снова перемешивают.

 

Определение кинетических параметров, KM и Vmax, реакции гидролиза ацетилтиохолина под действием ацетилхолинэстеразы

1. В пяти пробирках в соответствии с приведенной ниже таблицей готовят разведения ацетилтиохолина (исходная концентрация 10 –3 М):

 

№ пробирки (разведения) Концентрация АТХ, мМ V АТХ , мл V буфер*), мл
       
  0, 5    
  0, 4 0, 8 1, 2
  0, 2 0, 4 1, 6
  0, 1 0, 2 1, 8

*) – 0, 1 М натрий-фосфатный буфер рН 7, 40 (далее – «буфер»)

 

2. В фотометрическую кювету вносят:

0, 5 мл мембран эритроцитов,

0, 2 мл буфера;

0, 5 мл реактива Эллмана.

Смесь тщательно перемешивают.

3. Затем, по секундомеру, в кювету при тщательном перемешивании добавляют 0, 5 мл раствора АТХ из пробирки №1 (см. таблицу).

4. Кювету помещают в спектрофотометр и через 10 секунд после внесения АТХ обнуляют значение оптической плотности при 412 нм.

5. Регистрируют изменение оптической плотности при 412 нм в течение 2 мин с интервалом 20 секунд (9 точек).

6. Для разведений субстрата в пробирках №2, №3, №4 и №5 (см. таблицу) манипуляции повторяют согласно пунктам 2-5.

7. Полученные данные заносят в таблицу.

 

t, секунды Оптическая плотность, А412
Разведение №1 Разведение №2 Разведение №3 Разведение №4 Разведение №5
           
           
           
           
           
           
           
           
           
           

 

8. Результаты измерений отражают графически в виде зависимостей оптической плотности от времени, характеризующих кинетику данной ферментативной реакции при разных концентрациях субстрата (все пять графиков строят на одних координатных осях).

9. Затем строят график зависимости скорости данной ферментативной реакции от концентрации субстрата. Скорость реакции выражают в значениях оптической плотности от концентрации АТХ (то есть для каждого разведения), полученных в один и тот же промежуток времени. Для построения графика используют значения оптической плотности, полученные через 60 секунд от начала реакции. График строят в соответствии с ниже приведенной таблицей:

 

№ разведения Концентрация АТХ, мМ Данные для построения графика по уравнению Михаэлиса-Ментен Данные для построения графика Лайнуивера-Берка
Конечная концентрация АТХ (в кювете), мМ А412 при t=60 c 1/[АТХ]*) 1/А412
           
  0, 5        
  0, 4        
  0, 2        
  0, 1        

*) – [АТХ] – конечная концентрация АТХ.

 

10. Полученную зависимость преобразуют в координатах Лайнуивера-Берка в соответствии с таблицей, и рассчитывают значения KM и V max, характеризующие гидролитическое расщепление АТХ под действием ацетилхолинэстеразы.

 







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1346. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...

Расчетные и графические задания Равновесный объем - это объем, определяемый равенством спроса и предложения...

Кардиналистский и ординалистский подходы Кардиналистский (количественный подход) к анализу полезности основан на представлении о возможности измерения различных благ в условных единицах полезности...

Обзор компонентов Multisim Компоненты – это основа любой схемы, это все элементы, из которых она состоит. Multisim оперирует с двумя категориями...

Тактические действия нарядов полиции по предупреждению и пресечению групповых нарушений общественного порядка и массовых беспорядков В целях предупреждения разрастания групповых нарушений общественного порядка (далееГНОП) в массовые беспорядки подразделения (наряды) полиции осуществляют следующие мероприятия...

Механизм действия гормонов а) Цитозольный механизм действия гормонов. По цитозольному механизму действуют гормоны 1 группы...

Алгоритм выполнения манипуляции Приемы наружного акушерского исследования. Приемы Леопольда – Левицкого. Цель...

Основные симптомы при заболеваниях органов кровообращения При болезнях органов кровообращения больные могут предъявлять различные жалобы: боли в области сердца и за грудиной, одышка, сердцебиение, перебои в сердце, удушье, отеки, цианоз головная боль, увеличение печени, слабость...

Вопрос 1. Коллективные средства защиты: вентиляция, освещение, защита от шума и вибрации Коллективные средства защиты: вентиляция, освещение, защита от шума и вибрации К коллективным средствам защиты относятся: вентиляция, отопление, освещение, защита от шума и вибрации...

Задержки и неисправности пистолета Макарова 1.Что может произойти при стрельбе из пистолета, если загрязнятся пазы на рамке...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.014 сек.) русская версия | украинская версия