Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ




Цель занятия. Ознакомить студентов с типами питательных сред, методами их конструирования и культивированием микро­организмов.

Оборудование и материалы. Агар-агар, пептон, желатина, мяс­ная вода, перевар Хоттингера, МПА, МП Б, среды Китта—Тароцци, Эндо, Левина, Вильсон—Блера, Гисса, сухие питательные среды, кровяной МПА, потенциометр, индикаторные бумажки, стерильная дефибринированная кровь барана, термостат, анаэростат.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

К любой питательной среде предъявляют ряд основных требо­ваний: 1) стерильность и по возможности прозрачность; 2) со­держание необходимых для жизнедеятельности клеток биохими­ческих факторов — источников энергии, углерода, азота, серы, а также неорганических ионов — обязательно в форме, доступной для усвоения микроорганизмами; 3) оптимальные значения ряда биофизических показателей: концентрации водородных ионов (рН), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), актив­ности воды (aW), осмотического давления.

Концентрация водородных ионов (рН). Микроорганизмы способны существовать в строго определенных границах кислотности питательной среды. В зависимости от кислотного оптимума бактерии подразделяют на нейтрофилы, алкалофилы и ацидофилы.

Вода слабо диссоциирует, поэтому концентрация ионов водорода Н+ (реально существуют ионы Н9O4+ — гидратированная форма иона гидроксония Н3О+) и гидроксид-ионов ОН- в чистой воде при 25 °С составляет 10-7 моль/г. Преобладание в растворе водородных ионов определяет его кислую реакцию, гидроксильных — ще­лочную, при равной концентрации ионов Н+ и ОН- раствор нейтрален. Произве­дение концентраций водородных и гидроксильных ионов в конкретном растворе всегда равно постоянной величине (константе), которую называют ионным произ­ведением воды: К = (Н-7)(ОН-7) = 10-14. Следовательно, чтобы судить о реакции среды, достаточно определить концентрацию только одного из указанных ионов. Обычно определяют концентрацию ионов водорода. Вместо концентрации ионов водорода указывают ее десятичный логарифм, взятый с обратным знаком, называ­ют эту величину водородным показателем и обозначают символом рН = -lg (Н+). Измеряют рН питательных сред потенциометрическим (электрометрическим) или колориметрическим способами.

Последовательность операций при определении рН на иономере И-130 приве­дена далее. (Показания стеклянного электрода предварительно калибруют по буфе­рам с точно известными значениями рН.)

1. Прибор включают в сеть и прогревают в течение 30 мин.

2. Так как температура раствора влияет на результат определения рН, на штативе устанавливают термометр или автоматический термокомпенсатор. Переключатель рода термокомпенсации на передней панели переводят в соответствующее по­ложение.

Стаканчик предварительно ополаскивают анализируемым раствором, элект­роды промывают дистиллированной водой и также ополаскивают анализируемым раствором, подсушивают фильтровальной бумагой.

Анализируемый раствор наливают в стаканчик, в который погружают элект­роды. Время снятия показаний не более 3 мин.

После окончания измерений электроды промывают дистиллированной во­дой и погружают в стаканчик с дистиллированной водой.

При колориметрическом определении используют индикаторы. Все индикато­ры представляют собой слабые кислоты или основания, и их диссоциация в раство­ре зависит от концентрации водородных ионов. Недиссоциированная молекула индикатора и его ионы разного цвета. Внося индикатор в раствор с неизвестной концентрацией водородных ионов, сопоставляют его цвет в исследуемом растворе с цветом раствора с известным значением рН. Грубую оценку рН (±0,2) проводят с помощью бумажных индикаторов, к которым приложена цветовая шкала: каждая цветная полоса на бумажной карточке соответствует определенному значению рН. Универсальный индикатор изменяет окраску в диапазоне рН от 2 до 10.

Большинство бактерий растут в питательных средах со слабощелочными значе­ниями рН (6,8...7,6), грибы — в кислых средах (рН 3,0...6,0). рН среды доводят до нужного значения дробным внесением слабых растворов щелочи, 10%-го раствора соды или кислоты. Например, надо приготовить 1000 мл МПБ с рН 7,4. При стери­лизации сред рН обычно снижается приблизительно на 0,2, поэтому перед стери­лизацией рН среды доводим до 7,6. Для этого к 40 мл МПБ с исходным значением рН добавляем 4 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия. Следовательно, на 1000 мл МПБ необходимо добавить в 25 раз больше раствора щелочи (100 мл).

В процессе роста микроорганизмов на питательных средах кислотность доста­точно быстро может выйти за пределы оптимальной. Чтобы поддержать необходи­мое значение рН, в среды нередко добавляют фосфатные буферные смеси. При вы­ращивании микроорганизмов в реакторах рН среды корректируют периодическим добавлением раствора щелочи или кислоты.

Окислительно-восстановительный потенциал (ОКВП, Eh). Рост микроорганиз­мов тесно связан с окислительно-восстановительными условиями питательной среды, которые влияют на работу окислительно-восстановительных систем мик­робных клеток. ОКВП принято отсчитывать относительно окислительно-восста­новительного потенциала водорода H2↔2Н++2е Стандартное значение потенци­ала этой реакции при рН 7,0 (Е0) составляет —420 мВ. Большое отрицательное зна­чение стандартного ОКВП водорода характеризует его высокую восстановительную способность, т. е. способность отдавать электроны. Стандартный ОКВП системы Н20↔1/2 О2+ 2Н+ + 2е равен 820 мВ. Большое положительное значение потенци­ала в данном случае объясняет низкую способность воды отдавать электроны и од­новременно высокую способность молекулярного кислорода акцептировать элект­роны. ОКВП можно измерять электрометрическим способом. В этом случае ис­пользуют электрод измерения и электрод сравнения, потенциал последнего по от­ношению к стандартному водородному электроду известен. ОКВП системы по отношению к водороду обозначают как Eh. Измеряют Eh питательной среды, на­пример, при помощи иономера И-130.

Прибор включают в сеть и прогревают 30 мин.

Переключатель рода работ переводят в положение «V».

Погружают электроды в стакан с раствором, при этом следят, чтобы электрод сравнения был установлен на несколько миллиметров ниже измерительного.

После установления показаний их снимают в мВ.

Для корректировки ОКВП питательных сред в них добавляют различные веще­ства (см. «Культивирование анаэробных бактерий» в данной теме).

В питательных средах повышение ОКВП в основном связано со степенью на­сыщения кислородом. Аэробы хорошо растут при высоких положительных значе­ниях Eh, рост большинства анаэробов прекращается при Eh, выше —100 мВ, а стро­гих анаэробов — при Eh превышающем —330 мВ.

О значении Eh также можно судить по цвету окислительно-восстановительных красителей, которые окрашены в окисленном состоянии и бесцветны в восстанов­ленном. Различные красители восстанавливаются при разных значениях Eh, поэто­му подбором красителей можно контролировать ОКВП питательных сред. Значе­ние Eh, при котором краситель окислен или восстановлен на 50 % при рН 7,0, на­зывают стандартным ОКВП (Е0). Например, для метиленового синего Е0 составля­ет 11 мВ, резоруфина - 51 мВ, феносафранина - 252 мВ.

Активность воды и осмотическое давление. Микроорганизмы поглощают пита­тельные вещества в виде растворов, поэтому вода — абсолютно необходимый ком­понент любой среды. Минимальная предельная влажность питательной среды для роста бактерий составляет 20...30 %, грибов — 15%. Однако вода в питательной среде частично связана с растворенными в ней веществами и поэтому недоступна для микроорганизмов. Содержание воды в доступной для микробов форме выра­жают показателем активности воды (а„), которую определяют как отношение дав­ления водяного пара над питательной средой (раствором) к давлению паров над чистой водой (Р/Р0)- У дистиллированной воды aw = 1,0. Бактерии растут в средах с 0w = 0,95...0,99. Активность воды в среде можно определить по формуле аw = A/100, где А — относительная влажность (%) атмосферы, которую измеряют при равнове­сии в закрытом сосуде, содержащем питательную среду.

Существенное отклонение осмотического давления питательной среды от оп­тимального тормозит рост бактерий. Именно по этой причине соль и сахар в высо­ких концентрациях используют для консервирования пищевых продуктов. Среди болезнетворных бактерий только некоторые виды способны расти при повышен­ных концентрациях хлорида натрия в питательной среде (стафилококки, листерии). Наиболее доступный способ достижения оптимальных значений осмотичес­кого давления и активности воды в бактериологических питательных средах — это добавление в них хлорида натрия (0,5 %) или некоторых других солей.






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 341. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.006 сек.) русская версия | украинская версия