Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Классификация питательных сред и способы их приготовления





Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава.

В зависимости от химического состава и исходных компонен­тов различают следующие типы питательных сред.

Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на: 1) среды животного происхождения (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.); 2) среды растительного проис­хождения (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.д.).

Некоторые продукты используют в натуральном виде (карто­фель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и раститель­ные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).

Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, амино­кислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соот­ношении. Синтетические питательные среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально осво­бодить от балластных органических соединений, входящих в со­став обычных сред, например при получении диагностических ал­лергенов или при изучении метаболических потребностей микро­организма в том или ином конкретном химическом соединении.

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды.Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды. Необходимую кон­систенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.

Агар-агар (малайское желе) — полисахарид, продукт пе­реработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80...86 ºС, затвердевает при 40 ºС. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5...2%, реже 3 %; полужидких — 0,3...0,7%.

Желатина — экстракт из тканей, содержащих много кол­лагена (кости, хрящи, сухожилия и т.д.). Желатиновый гель пла­вится при 25 °С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37...38 °С. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, раз­лагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10...20 % желатины.

По целевому назначению различают общеупотребительные (ос­новные), обогащенные, специальные, элективные (избиратель­ные) и дифференциально-диагностические питательные среды.

Общеупотребительные (основные) среды. Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганиз­мов.

В качестве исходных компонентов для приготовления основ­ных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.

Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш залива­ют водопроводной водой в соотношении 1: 2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-мар-левый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первона­чального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-мар-левыми пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов пу­тем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °С и добавляют панкреатин, подщелачивают ра­створом карбоната натрия до рН 7,8...8,0, встряхивают и добавля­ют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теп­лом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).

Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона[1] и 0,5 % хлорида натрия, устанавли-

 

Рис. 32. Приготовление скошенного агара

 

вают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бу­мажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 "С 15...20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2...3 % промытого мелко нарезанного агар-агара, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде прове­ряют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значе­ния (7,2...7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Про­фильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 20...30 мин. Чтобы по­лучить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят) (рис. 32).

Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандарт­ной чашки Петри (рис. 33) около 10 см, выпускают чашки мень­шего и большего диаметров, а также одноразовые пластиковые. В

 

 

 
 

 

стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки на­ливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45...50 "С питательного агара, чашки помещают на горизонтальную по­верхность до застывания агара.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25 % агара. Кипятят при по­мешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2...7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ до­бавляют 10...20% измельченной желатины, нагревают до рас­плавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2...7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробир­кам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин.

Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1 :5 (1:8) до со­держания аминного азота 120 мг%, добавляют 0,5% хлорида на­трия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4...7,6, кипя­тят 15...20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °С 20...30 мин.

Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хот­тингера 2 % агар-агара.

Предприятия биологической промышленности выпускают го­товые питательные бульон и агар в виде сухого порошка.

Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки — 10,05, хлорид натрия — 4,95. Навеску по­рошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, ки­пятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 ºС 20 мин (рН 7,3).

Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей — 12,0; агар— 12,5; хлорид на­трия — 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дис­тиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при 120 "С 20 мин (рН 7,3).

Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, по­этому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, уг­леводы и т. д. Такие питательные среды получили название обо­гащенных.

Сывороточный и кровяной агары: к рас­плавленному и охлажденному до 45...50°С стерильному пита­тельному агару добавляют 5...10% стерильной дефибринирован-ной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, круп­ного рогатого скота, кролика). Для получения дефибринирован-ной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стек­лянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15...20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах.

Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, про­бирки и оставляют до застывания питательной среды.

Сывороточный и кровяной бульоны гото­вят аналогичным образом.

Растворы углеводов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5... 1 % к питательной среде.

Специальные среды. Так называют среды, разработанные с уче­том специфических ростовых потребностей ряда бактерий. На­пример, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.

Среда Мак-Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0...7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4...5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертыва­ния сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °С 1 ч, на второй день при 85 °С 30 мин. Для контроля стерильности при­готовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37...38 °С.

Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсе-на и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсена: раствор А: гидро­фосфат натрия — 11,876 г, вода дистиллированная — 1000 мл; ра­створ Б: дигидрофосфат калия — 9,078 г, вода дистиллирован­ная — 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор раз­ливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм 20 мин. В каждую пробирку добавляют шесть—восемь капель стерильной инактивированной при 56 °С сыворотки кролика.

Элективные среды(лат. electus — избранный). Это питательные
среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественный рост искомого микроорганизма и
(или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей
микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть
плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят

цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.

Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2...7,4, содержащему 5...7,5 % хлорида натрия, до­бавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, перемешива­ют и разливают в чашки Петри.

Среда Шустовой предназначена для выделения саль­монелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10 % к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2 % раствора Люголя.

Среда Раппопорт предназначена для культивирова­ния сальмонелл. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи, 1 % индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.

Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 "С 30 мин. Затем стериль­но добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия — 50 г, дистиллированная вода — 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.

Среда Кауфмана — это среда обогащения для сальмо­нелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1 : 1000, и 5 мл стериль­ной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин.

Казеиново-угольный агар (КУА) с пеницилли­ном используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дис­тиллированной воды добавляют гидролизат казеина — 20 мл, хлорид натрия — 5 г, хлорид калия — 0,2 г, хлорид кальция — 0,002 г, карбонат натрия — 0,4 г, хлорид магния — 0,025 г, гидро­фосфат калия — 0,24 г, растворимый крахмал — 1 г, цистин — 0,01 г, агар —20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Перед употреблением в рас­плавленный агар (50 °С) добавляют 3 % дрожжевого экстракта и 0,2 % сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции мо­гут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изуча­емого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН сре­ды в результате расщепления субстрата.

К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.

Среды Гисса используют для изучения ферментатив­ных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл ди­стиллированной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 г хлорида на­трия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0...7,4, добавляют один из углево­дов-субстратов (лактоза, глюкоза и т.д.), агар-агар (0,3...0,4 %), а затем 1мл индикатора Андрэдэ или 0,1мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в про­бирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °С 20 мин.

Выпускают сухие среды Гисса с индикатором BP — смесь вод­но-голубого с розоловой кислотой (готовые среды — полужидкой консистенции).

Плотные дифференциально-диагностические среды применя­ют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их со­став нередко кроме известного субстрата входят вещества, при­дающие питательной среде селективные свойства.

Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу.

К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °С добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в неболь­шом количестве дистиллированной кипяченой воды. В отдель­ных пробирках готовят: 2...3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-го водного раствора сульфата натрия.

В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и до­бавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, переме­шивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, сре­да закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и ко­лония микроорганизма, например эшерихий, приобретает крас­ный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед упот­реблением определенную навеску порошка вносят в дистиллиро­ванную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.

Среда Левина аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метилено-вым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2...7,4) добав­ляют 2 мл 0,5%-го водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 г дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин. Лактозу и дигидрофос-фат калия предварительно разводят в небольшом количестве сте­рильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопо-зитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет.

Агар Плоскирева предназначен для выделения саль­монелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпуска­ют в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой ос­новы входят: желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, йод, хлорид натрия, лактоза, нейтральный красный. Навес­ку порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розоватая. Колонии саль­монелл бесцветные, эшерихий — брусничного цвета.

 
 

Методы культивирования микроорганизмов. Наряду с общими принципами культивирование микроорганизмов различных фи­зиологических групп имеет некоторые особенности Культивирование аэробных и факультативно-анаэробных бак­терий. Плотные, жидкие или полужидкие питательные среды, засеянные чистыми культурами микроорганизмов или исследуе­мым материалом, помещают в термостаты (рис. 34), поддержива­ющие оптимальную для данного микроорганизма температуру. При температурах, превышающих верхнюю границу нормы, бак­терии не только замедляют рост, но и быстро гибнут. При темпе­ратуре ниже оптимальной скорость роста микроорганизма посте­пенно замедляется.

 

У мезофилов температурный оптимум находится в интервале 30...37 ºС, у психрофилов — 10... 15 ºС, у термофилов — 50...60 ºС.

Микроорганизмы в процессе культивирования на питатель­ных средах при условии, что в среды не вносят дополнительные вещества, постепенно замедляют и затем прекращают свой рост из-за истощения питательного субстрата, изменения оптималь­ных значений биофизических показателей (рН, Eh и т.д.). Такое культивирование микроорганизмов называют периодическим. Если при этом жидкую питательную среду в процессе инкубирования посевов не перемешивают, то такой способ куль­тивирования определяют как стацио­нарный. При диагностических бакте­риологических исследованиях обыч­но используют именно такой способ культивирования. В биологической промышленности при производстве вакцин и других биопрепаратов, ког­да необходимо достичь максимально­го выхода бактериальной массы или экзотоксинов, применяют периодическое культивирование в жидких средах с их интенсивным перемешиванием.

При таких задачах аэробные бактерии культивируют в колбах, бутылях на шюттель-аппаратах с частотой колебания 150... 250 мин-1, что облегчает передачу бактериям кислорода и пита­тельных компонентов.

 

 

Рис. 35. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов.

1 – вход воздуха; 2 – выход воздуха; 3 – отбойники; 4 – мешалка; 5 - барботер

 

Наиболее эффективное культивирование бактерий в жидких питательных средах с максимальным выходом биопродукта дос­тигают в ферментерах. Ферментеры (реакторы) представляют со­бой металлические или стеклянные культуральные сосуды емко­стью от 500 мл до 1000 л (рис. 35). При культивировании бакте­рий в ферментерах среду перемешивают специальными мешал­ками с одновременной подачей необходимого количества стерильного воздуха. Ферментеры конструируют как автономные системы с автоматической регуляцией температуры и рН среды. В ферментерах также осуществляют непрерывное (проточное) культивирование, при котором в отличие от периодической куль­туры автоматически в среду подаются свежие питательные ком­поненты со скоростью, равной удалению аналогичного объема выросшей культуры бактерий. Такое непрерывное культивирова­ние в хорошо отрегулированной системе в принципе можно про­должать неограниченно долго.

Культивирование анаэробных бактерий. Облигатные анаэро­бы — бактерии, у которых энергетический и конструктивный ме­таболизм происходит без молекулярного кислорода 02. У таких микроорганизмов в процессе дыхания конечными акцепторами

электронов являются окись углерода (IV), ионы сульфата, фумарат и др. Кроме того, молекулярный кислород действует на многие анаэробы губительно. Например, строгие анаэробы погибают при незначительных концентрациях кислорода (бактероиды, фузобак-терии), умеренные анаэробы менее чувствительны (С. perfringens), аэротолерантные анаэробы могут расти в условиях обычной ат­мосферы (молочнокислые бактерии). Большинство болезнетвор­ных анаэробов относят к строгим или умеренным анаэробам. Для их культивирования используют специальные питательные среды и газовые смеси. Последними наполняют анаэростаты.

Необходимое условие роста облигатных анаэробов — не столько отсутствие молекулярного кислорода, сколько низкий ОКВП питательных сред. Резко восстановительных условий достигают, добавляя в среды редуцирующие (восстанавливающие) вещества и одновременно удаляя из них молекулярный кисло­род. В качестве редуцирующих веществ в питательные среды добавляют химические соединения, приведенные в таблице 1.

 

1. Восстанавливающие вещества для культивирования анаэробов

Восстановитель Е0, мВ Содержание восстановителя в среде, %
Тиогликолят натрия < —100 0,05
Хлорид цистеина -210 0,025
Дитиотрейтол -330 0,05
Цитрат титана (III) -480 0,5...2мМ
Хлорид цистеина + сульфид -571 0,025 + 0,025 %
натрия    

С этой же целью в питательные среды вносят вареные кусоч­ки печени, мышц, мозга, кровяные сгустки, куриный яичный бе­лок, зерна ржи. Считают, что в этих тканях сильное редуцирую­щее действие оказывают вещества, богатые SH-группами.

Для создания условий анаэробиоза питательные среды макси­мально освобождают от кислорода путем кипячения, а также пропуская через жидкие среды инертные газы или наслаивая на поверхность питательной среды вазелиновое масло для предотв­ращения контакта с кислородом воздуха.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта—Тароцци — традиционная среда для культиви­рования анаэробов. Ее основой служит печеночная вода, кото­рую готовят путем кипячения в воде мелких кусочков говяжьей печени (соотношение 1:1). Печеночную воду смешивают с МПБ в соотношении 1:2, смесь кипятят, устанавливают необходимый рН и разливают в пробирки по 10 мл. В пробирки добавляют ку­сочки вареной печени (восстановитель) и затем вносят по 2 мл вазелинового масла. Автоклавируют при 0,5 атм 20 мин. Перед употреблением пробирки со средой кипятят в водяной бане, за­тем охлаждают и только после этого проводят посев.

Для выращивания анаэробов используют также питательные среды с повышенной вязкостью, поскольку диффузия кислорода в них затруднена.

Полужидкий агар: к МПБ добавляют 0,25...0,75 % агара, 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки высоким столбиком и дробно стерилизуют.

Практикуют культивирование анаэробов в толще плотных сред.

Сахарный агар в трубках Вейона: к 2%-му МПА добавляют 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4. Посевной материал вносят в расплавленную и охлажденную до 48...50 "С среду, перемешивают и разливают по стерильным узким стек­лянным трубкам — трубкам Вейона (длина 20...25 см, диаметр 1...1,5 см). Концы трубок закрыты стерильными резиновыми пробками. Колонии анаэробов вырастают в толще питательной среды.

Широко применяют культивирование анаэробов на поверхно­сти плотных питательных сред в чашках Петри.

Из числа плотных сред для культивирования анаэробов до­вольно часто используют кровяной агар с глюкозой и железо-сульфитный агар.

Глюкозо-кровяной агар: к 3%-му МПА (рН 7,2...7,4), расплавленному и охлажденному до 50°С, добавляют 1...2% стерильного раствора глюкозы, 15...20% дефибриниро-ванной крови барана и разливают по чашкам Петри.

Железо-сульфитный агар (среда Вильсон—Блера): к 100 мл 3%-го МПА (рН 7,4) с 1 % глюкозы при температуре 60 °С добавляют 10 мл 20%-го раствора сульфита натрия и 1мл 8%-го раствора хлорида железа, затем среду разливают по чаш­кам Петри. Анаэробы при росте на этой среде восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия, который реагирует с хлори­дом железа, образуя черный осадок сульфита железа; колонии бактерий окрашены в черный цвет.

Для культивирования анаэробов на поверхности плотных пи­тательных сред недостаточно добавления в них восстанавливаю­щих агентов. Культуральные сосуды с посевами помещают в гер­метические камеры (анаэростаты), в которых тем или иным спо­собом создают анаэробные (бескислородные) условия.

Обычный анаэростат представляет собой металлический ци­линдр, который герметически закрывает крышка с резиновой прокладкой (рис. 36). На крышке размещены манометр и краны для откачивания воздуха или наполнения анаэростата инертным газом (азот). Воздух откачивают с помощью вакуумного насоса, закручивают вентиль и анаэростат с пробирками или чашками помещают в термостат. Обычное остаточное давление в анаэро-стате около 10 мм рт. ст. Созданы анаэростаты, удаление кисло­рода из которых происходит за счет его реакции с водородом в

 

 
 

присутствии катализатора (платино­вый, палладиевый). Водород в камеру закачивают из баллона через редук­тор. Некоторые анаэробные камеры снабжены нагревательными элемен­тами с терморегулирующим устрой­ством, обеспечивающим автономное поддержание температуры на необхо­димом уровне.

Культивирование микроаэрофильных бактерий. Хотя микроаэрофильные бактерии по типу дыхания аэро­бы, они растут не в обычной атмос­фере (21 % кислорода), а с понижен­ным содержанием кислорода. Например, Campylobacter fetus рас­тет в атмосфере, содержащей не более 6 % кислорода. Такую ат­мосферу можно создать в герметичных термостатах, анаэростатах, заменяя часть воздуха сжатым оксидом углерода (IV) из бал­лона, или в обычном эксикаторе. В последнем случае пробирки с посевами помещают в эксикатор вместе с бюксом, содержащим ватку, смоченную спиртом, или свечу. Вату (свечу) зажигают и закрывают крышку эксикатора. Пламя затухает по мере выгора­ния кислорода, и снижение его содержания достаточно для роста микроаэрофилов.

Наиболее доступен и эффективен способ культивирования микроаэрофилов в полужидкой среде с 0,1...0,4 % агара. В такой среде конвекционные потоки не способны перемешивать верхние, богатые кислородом слои среды с нижними, что создает в среде, заполняющей пробирку, градиент концентрации кислоро­да. Культуру микроаэрофила засевают уколом, и микроорганизм растет в зоне с оптимальным содержанием кислорода, обычно в виде тонких дисков на расстоянии от нескольких миллиметров до нескольких десятков миллиметров от поверхности среды.

Культивирование грибов.Лучший рост грибов отмечен на сре­дах с содержанием углеводов 1...4%. При первичной изоляции для подавления роста различных сопутствующих бактерий в пи­тательные среды часто добавляют антибиотики.

Агар Сабуро применяют для культивирования возбуди­телей дерматомикозов и кандидамикоза. Глюкоза —4 г, пеп­тон — 1 г, агар — 1,8 г, дистиллированная вода — 100 мл. После растворения агара среду фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 6,9...7,0.

Агар Чапека используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза — 30 г, нитрат натрия — 2 г, дигидрофос­фат калия — 1, сульфат магния — 0,5 г, хлорид калия — 0,5 г, сульфат железа —0,0012 г, агар —20 г, дистиллированная вода — 1000 мл. Естественный рН среды 5,6...5,9. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Сусло-агар предназначен для культивирования возбу­дителей дерматомикозов и кандидамикоза. Солодовое неохме-ленное сусло разбавляют водопроводной водой в соотношении 1: 2 (до содержания Сахаров 7 %), устанавливают рН 6,5...6,7, до­бавляют 2 % агара, кипятят, фильтруют, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Агар Литмана пригоден для культивирования дерматофитов. Пептон — 10 г, глюкоза — 10 г, бычья желчь — 15 г, кристаллвиолет —0,01 г, агар —20 г, дистиллированная вода— 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Среда Ван-Итерсона предназначена для выделе­ния из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохиотоксикоз и др. Нитрат аммония — 0,5 г, ди­гидрофосфат калия — 0,5 г, водопроводная вода — 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 30 миц. Затем средой увлажняют стериль­ные чашки Петри с фильтровальной бумагой.

Жидкая среда Чапека. Глюкоза — 30г, нитрат на­трия — 2 г, дигидрофосфат калия — 1 г, сульфат магния — 0,5 г, хлорид калия —0,5 г, сульфат железа — 0,001 г, дистиллирован­ная вода — 1000 мл. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 5,9...6,2. Жидкую среду можно использо­вать для увлажнения фильтровальной бумаги в чашках Петри с целью последующего культивирования грибов.

Среда Билай предназначена для получения макроко­нидий грибов. Нитрат калия — 2 г, дигидрофосфат калия — 1 г, сульфат магния —0,5 г, хлорид калия —0,5 г, сульфат железа — следы, крахмал растворимый — 0,1 г, сахароза — 0,1 г, глюкоза — 0,1 г, дистиллированная вода — 1000 мл. Среду разливают по про­биркам по 5 мл и в каждую пробирку вставляют полоску фильт­ровальной бумаги таким образом, чтобы большая часть ее нахо­дилась над раствором. Среду стерилизуют при 1 атм 20 мин.

Глюкозный бульон Сабуро используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза — 40 г, пептон — Юг, дистиллированная вода— 1000мл. Нагревают до кипения, разливают по пробиркам и стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Культивирование на волосах по Ван-брейзегему применяют при выделении дерматофитов. Здоровые стерильные волосы прикрепляют коллодием к стек­лянной трубочке. На середину волос наносят культуру гриба. Трубочку помещают в цилиндр, на дно которого для влажности наливают небольшое количество воды. Культивируют при 25 "С пять—десять дней и более.

Для выделения возбудителей гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита применяют кровяной агар.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить скошенный МПА, сывороточный и кровяной
МПА.

2. Изучить устройство анаэростата и ферментера.

 

Контрольные вопросы

1.Какие общие требования предъявляют к питательным средам?

2.На какие группы классифицируют питательные среды?

Как культивируют анаэробы и микроаэрофилы

 

Тема 8






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1691. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.128 сек.) русская версия | украинская версия