Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ТЕХНИКА ПОСЕВА, МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР И КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БАКТЕРИЙ





Цель занятия. Освоить технику посева микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды и методы выделения чис­тых бактериальных культур. Ознакомить студентов с основными культуральными характеристиками микроорганизмов и методами определения количества бактерий.

Оборудование и материалы. Бульонные и агаровые культуры В. cereus, Е. coli и S. aureus в пробирках и в чашках Петри, сме­шанная бульонная культура Е. соli и S. aureus, стерильные МПА и МПБ в пробирках, чашках Петри, солевой МПА (8 % хлорида натрия) в чашках Петри, стеклянные шпатели, стерильные пи­петки Пастера, бактериологические петли.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Культура микроорганизмов — это популяция (расплодка) кле­ток на питательной среде. Посев и пересев культур микроорга­низмов на питательные среды — наиболее частый методический прием, который используют для первичного выделения микро­организма из какого-либо объекта, а также для поддержания культур в жизнеспособном состоянии в лабораторных условиях.

Чистая культура — это популяция бактерий одного вида или биологического варианта (биовара), выращенная на питательной среде.

Штаммы — чистые культуры микроорганизмов одного вида, выделенные из разных объектов или из одного и того же объекта, но в разное время.

Колония — макроскопически видимое скопление клеток мик­роорганизма на поверхности или внутри плотной питательной среды, образовавшихся в результате размножения одной жизне­способной клетки. По этой причине колонию обычно рассматри­вают как чистую культуру микроорганизма.

Техника посева микроорганизмов. Посевы из нативного мате­риала чаще проводят пастеровской пипеткой, из культур микро­организмов—бактериологической петлей в зоне стерильного воздуха над пламенем горелки. На культуральных сосудах (про­бирки, чашки Петри, колбы и т.д.) пишут номер экспертизы, под которым зарегистрирован материал, дату посева.

Посев на жидкую питательную среду. Пробирку с исследуемым материалом и пробирку с питательной средой держат в левой руке, в правую руку берут бактериологическую петлю или пипет­ку и'пробки от пробирок (рис. 37). Над пламенем горелки обжи­гают края пробирок, бактериологическую петлю (пипетку) вводят в пробирку с материалом, переносят материал в пробирку со сте­рильной питательной средой и стряхивают с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель. Края пробирок вновь прово­дят над пламенем горелки, закрывают пробирки пробками, сте­рилизуют петлю и ставят ее в штатив. Использованную пипетку опускают концом вниз в банку с дезинфицирующим раствором.

Посев на плотную питательную среду. Выполняют разными способами.

 

 
 

 

 

При посеве в пробирку: 1) пробирки с засеваемой мик­робной культурой и питательной средой (МПА) берут в левую руку, пробирку с МПА держат скошенной поверхностью среды вверх. В открытую у пламени пробирку с микробной культурой (или другим материалом) вводят простерилизованную бактерио­логическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности сре­ды (материала), берут материал, переносят его в пробирку со сте­рильной питательной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразным движением проводят снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом») (рис. 38). Пробирки закрывают пробками, петлю прожигают. Пробирки с посевами ставят в термостат; 2) при по­севе уколом в столбик среды пробирку с плотной (нескошенной) средой берут в левую руку, над пламенем горелки извлекают из пробирки пробку, петлей с материалом прокалывают вертикаль­но по центру пробирки питательную среду, петлю вынимают, прожигают, пробирку с засеянной средой закрывают пробкой (рис. 39).

 

 

 

При посеве на чашку Петри: чашку берут в левую руку, большим пальцем левой руки слегка приподнимают крышку, об­жигают на пламени горелки края чашки в зоне щели, вносят по­севной материал на поверхность питательной среды, затем рас­тирают его при помощи стеклянного шпателя или бактериологи­ческой петли (рис. 40).

Посев на полужидкую питательную среду. Выполняют методом укола в столбик питательной среды.

Выделение чистых культур микроорганизмов. При бактериоло­гическом исследовании искомый микроорганизм обнаруживают в материале, как правило, в смеси с бактериями других видов. Классическими методами бактериологии возможно идентифици­ровать микроорганизм только при условии, что он находится в виде чистой культуры.

Методы, основанные на механическом разобщении клеток. Эти методы наиболее часто применяют при выделении чистых куль­тур микроорганизмов.

Метод Пастера (метод разведений): из исследуемого материала готовят ряд последовательных, чаще десятикратных разведений на стерильной жидкой питательной среде в пробир­ках или колбах (10-1…10-10). Предполагают, что количество мик­робных клеток в каждом последующем разведении будет меньше, чем в предыдущем, и в какой-то из пробирок останется только одна микробная клетка, которая и даст/начало чистой культуре Микроорганизма. Однако для успешного применения этого мето­да необходимо, чтобы искомый микроорганизм в материале ко­личественно преобладал над сопутствующими видами.

Метод Коха (метод заливок): исследуемый материал в небольшом количестве вносят в пробирку с расплавленным и ох­лажденным до 45...50 "С МПА, перемешивают, затем каплю пи­тательной среды переносят во вторую пробирку с расплавленным МПА и т. д. Количество разведений зависит от предполагаемой численности микроорганизмов в исследуемом материале. Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри, после затвердения среды посевы помещают в термостат. Фиксированные в плотной среде микробные клетки при размно­жении формируют колонии, из которых можно отвить (пересе­ять) чистую культуру микроорганизма.

Метод Дригальского: берут три—пять чашек Петри с плотной питательной средой. В одну из чашек вносят посевной материал и распределяют его шпателем по поверхности пита­тельной среды. Не обжигая шпатель, оставшийся на нем матери­ал последовательно растирают на поверхности среды во второй, третьей и остальных чашках. В последних чашках Петри после инкубирования в термостате обычно наблюдают формирование изолированных колоний бактерий.

 

Более экономичен следующий способ получения изолированных колоний. Бактериологичес­кой петлей с посевным матери­алом несколько раз делают па­раллельные штрихи в одном секторе чашки Петри с пита­тельным агаром (рис. 41). Пет- о лю прожигают в пламени горел­ки, дают остыть и часть матери­ала из первого сектора {А) ана­логичным образом распре­деляют во втором секторе (В), затем в третьем (С) и четвертом (Д) секторах. Даже при рассеве бактериальной массы из коло­ний в секторе Д при таком спо­собе получают рост изолирован­ных колоний.

Методы, основанные на био­логических особенностях микроорганизмов.Направлены на подав­ление роста сопутствующей микрофлоры.

Прогревание: при выделении чистой культуры споро-образующего вида бактерий исследуемый материал прогревают при 80 °С 20 мин или кратковременно кипятят. Вегетативные клетки сопутствующей микрофлоры в этих условиях погибают, а споры искомого микроорганизма сохраняют жизнеспособность и прорастают после посева на питательные среды.

Использование селективных питатель­ных сред, которые содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры (антибиотики, красители и т. д.), — частый прием при исследовании контаминированного материа­ла. Однако необходимо учитывать, что селективные факторы ча­сто находятся не в бактерицидных, а в бактериостатических кон­центрациях, поэтому клетки сопутствующих микроорганизмов не растут, но остаются жизнеспособными на поверхности пита­тельной среды и при отвивке колоний исследуемой культуры на обычные среды могут быть причиной получения смешанной культуры.

Биопроба — заражение чувствительных лабораторных животных — метод, с помощью которого не только выделяют возбудитель из патологического материала, но также изучают вирулентность чистой культуры. Организм животного с его за­щитными факторами служит биологическим «фильтром», кото­рый уничтожает сопутствующую непатогенную микрофлору, но не способен подавить размножение вирулентных бактерий, что позволяет достаточно легко выделить возбудитель в чистой культуре из тканей погибшего или убитого с диагностической целью животного.

При выделении чистых культур некоторых видов бактерий ис­пользуют их другие биологические особенности. Например, спо­собность микроорганизма расти при низких (листерии) или высо­ких (термофильные бактерии) температурах, которые лежат за пределами температурных диапазонов сопутствующих видов бак­терий. Для выделения культуры P. vulgaris используют способность данного вида давать ползучий рост (роение) на поверхности плот­ной питательной среды. С этой целью материал, содержащий P. vulgaris, засевают в конденсационную воду на дне пробирки со скошенным МПА, не касаясь поверхности среды. Сопутствующая микрофлора растет в нижней части питательной среды, а протей в виде прозрачной пленки распространяется вверХ.

Для выделения С. tetani материал засевают точечно на плот­ную питательную среду в чашках Петри и после выращивания отвивают культуру с периферии ползучего роста.

Культуральные свойства микроорганизмов. В процессе иденти­фикации наряду с другими свойствами у микроорганизмов изу­чают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных ус­ловиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бакте­рии каждого вида формируют колонии с определенными призна­ками, которые обычно учитывают при идентификации. Раз­мер колоний: крупные — диаметром 4...6 мм и более, сред­ние—2...4 мм, мелкие — 1...2мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм. Форма колоний может быть правильной круг­лой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневид­ной (рис. 42). Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцвет­ные колонии. Учитывают характер поверхности, ко­торая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной. Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренны­ми, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа (рис. 43). Рельеф (про­филь) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусо­видным центром или углублением в центре колонии, с утолщен­ными (валикообразными) краями (рис. 44). Учитывают про­зрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, про­зрачная. Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т.д. (рис. 45). Ее выявляют при слабом увеличе­нии микроскопа. Консистенция может быть пастообраз­ной, слизистой, плотной (сухой) и т.д.; ее определяют, дотраги­ваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некото­рых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли. Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.

 

 

 


 

Ценную дополнительную информацию об особенностях стро­ения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света (рис. 46). Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Пет­ри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной лупой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40...45°. Зеркало устанавливают на равном уда

       
 
   
 

лении от объекта и источника света (12...14 см). При таком осве­щении колонии бактерий могут быть окрашены в различные цве­та. Цвет зависит как от видовых особенностей, так и от состоя­ния культуры (S-, R-формы, см. тему 12).

В жидких средах учитывают следующие признаки: степень помутнения среды (интенсивное, среднее, слабое), на­личие или отсутствие пристеночного кольца на гра­нице мениска и внутренней поверхности пробирки, харак­тер поверхностной пленки (толщина, цвет, поверхность), характер осадка (обильный, скудный, ком­пактный, хлопьевидный, слизистый). При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок раз­бивается в гомогенную равномерную суспензию; образуются мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).

Определение количества бактерий. При характеристике разви­тия микробной популяции, санитарной оценке кормов, продук­тов питания, при вычислении показателя вирулентности микро­организма необходимо устанавливать количество микробных клеток в единице объема того или иного материала.

Определение общего количества микроорганизмов. Можно при­менять метод прямого счета и метод измерения светорассеяния.

Метод прямого счета: бактерии подсчитывают в камерах Горяева, Тома или в окрашенных мазках. В последнем случае 0,01 мл бактериальной суспензии микропипеткой нано­сят на предметное стекло и равномерно распределяют на 1 см2. Мазок фиксируют, окрашивают и подсчитывают клетки в 10... 15 полях зрения по диагонали квадрата. Определяют сред­нее число клеток в одном поле зрения. Делят 1 см2 на площадь поля зрения, которую измеряют методом микрометрии (см. тему 1), затем частное умножают на среднее число микробных клеток в поле зрения, получают их количество в 0,01 мл взвеси бактерий.

Метод измерения светорассеяния считают более точным. Количество света, рассеиваемого суспензией бак­терий, пропорционально их концентрации. Этот показатель дос­таточно точно можно измерить при помощи фотоэлектроколориметра. Зависимость между оптической плотностью и концентра­цией клеток различна для бактерий разных видов. Поэтому при работе с таким прибором для каждого вида бактерий необходимо строить свою калибровочную кривую зависимости.

На практике широко используют простой субъективный ме­тод, основанный на визуальном сравнении мутности исследуе­мой бактериальной суспензии с так называемым «стандартом мутности», выпускаемым Государственным научно-исследова­тельским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича. Стандарт представляет собой взвешенные в воде частицы стекла «Пирекс» и состоит из трех запаянных пробирок-эталонов (5, 10 и 20 международных еди­ниц). Мутность стандарта на 10 ед. соответствует следующим кон­центрациям: для бактерий кишечной группы — 0,93*109 кл/мл; коклюшной группы — 11 • 109 кл/мл; для бруцеллезных бакте­рий — 1,7 • 109 кл/мл; туляремийных микробов — 5 • 109 кл/мл.

Мерной пипеткой вносят 0,1...0,5 мл исследуемой бактериаль­ной суспензии в пустую пробирку, соответствующую по диамет­ру и толщине стенок пробирке «стандарта мутности». К суспен­зии добавляют физиологический раствор до оптической плотнос­ти стандарта на 10 ед. Физиологический раствор вносят неболь­шими мерными порциями, записывая его количество и сравнивая мутность опытной и стандартной пробирок невоору­женным глазом на фоне специальной шрифтовой таблицы. Зная, во сколько раз развели исследуемую бактериальную суспензию, чтобы уравнять ее оптическую плотность со стандартом, можно рассчитать содержание микробных клеток в 1 мл исходной сус­пензии.

Например, в пробирку поместили 0,1 мл суспензии бактерий, содержащей неизвестное количество клеток. Для уравнивания оптической плотности исследуемой суспензии со стандартом мутности 10 ед. в пробирку добавили 0,9 мл физиологического раствора, т. е. исходную суспензию развели в 10 раз. Известно, что суспензия данного вида бактерий при оптической плотности 10 ед. содержит 1,3*109 кл/мл. Следовательно, концентрация ис­следуемой суспензии составляет 1,3*1010 кл/мл.

При работе с бактериями, для которых нет данных о содержа­нии микробных клеток в 1 мл относительно «стандарта мутнос­ти», необходимо предварительно методом прямого счета опреде­лить их количество в суспензии, например, оптической плотнос­тью 10 ед.

Определение количества живых микроорганизмов. Метод осно­ван на выводе, что бактериальная колония — это результат деле­ния единичной клетки на плотной питательной среде (исключе­ние составляют бактерии, образующие цепочки из клеток).

Мерной пипеткой объемом 1 мл добавляют 1 мл культуры Е. coli в бактериологическую пробирку с 9 мл стерильного физио­логического раствора, подогретого до 37...38 °С (разведение 10-1). Далее аналогичным способом готовят разведения культуры от 10-2 до 10-8. Для каждого разведения используют новую пипетку того же объема и класса. Из пяти последних пробирок суспензию бактерий по 0,1 мл наносят на поверхность подсушенного МПА в две чашки Петри. Внесенный материал стерильным шпателем распределяют по поверхности питательной среды. Посевы инку­бируют при 37...38 ºС 24 ч.

Учет результатов: в чашках Петри, где выросло более 150...300 и менее 10 колоний, результаты не учитывают. Выбирают чашки Петри с параллельными посевами (из одного разведения), содер­жащими 10... 150 колоний. Подсчитывают колонии на чашках из одного разведения, суммируют, определяют среднее число коло­ний и с учетом степени разведения рассчитывают содержание жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц) в 1 мл исходной суспензии бактерий.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести пересев бульонной и агаровой культур бактерий на скошенный МПА и в МПБ в пробирках.

2. Провести посев смешанной бульонной культуры на МПА в чашках Петри по методу Дригальского.

3. Описать характер роста Е. coli, S. aureus, В. cereus на МПА (колонии) и в МПБ.

4. Определить количество микробных клеток в 1 мл бульонной культуры Е. coli методом прямого счета и при помощи стандарта мутности.

5. Провести посев бульонной культуры Е. coli на МПА в чаш­ках Петри с целью определения количества жизнеспособных клеток.

Контрольные вопросы

1.Что такое культура, смешанная культура, чистая культура, штамм и колония бактерий?

2.Какие методы применяют для получения чистых культур микроорганизмов?

3.Какие культуральные признаки учитывают при идентификации бактерий?

4.Какими методами определяют общее число микроорганизмов и количество жизнеспособных клеток?

 

 

Тема 9






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 6664. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.086 сек.) русская версия | украинская версия