Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

БАКТЕРИОФАГИ





Цель занятия. Ознакомить студентов с действием бактериофа­гов и их практическим использованием.

Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма L. monocytogenes, набор листериозных бактериофагов, стериль­ный МПБ, содержащий 0,5 % глюкозы, 2%-й МПА в чашках Петри, стерильные пипетки Пастера, лечебно-профилактичес­кий бактериофаг против паратифа и колибактериоза телят, чув­ствительная к фагу культура Е. coli.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Бактериофаги представляют собой вирусы, адаптировавшиеся в процессе эволюции к паразитированию в прокариотических клетках (рис. 47). Репродукция многих бактериофагов в клетке приводит к ее лизису. На специфической адаптации фагов к строго определенным видам (штаммам) бактерий и внешнем проявлении поражения бактериальных клеток (лизис) основано практическое использование бактериофагов: при помощи извес­тного (диагностического) фага можно обнаружить и идентифи­цировать бактерии. Кроме того, биологическая промышленность выпускает лечебно-профилактические бактериофаги.

Определение литической активности бактериофага. У диагнос­тических и лечебно-профилактических фагов должна быть выра­жена литическая активность, которую определяют путем титро­вания фагов, например, в жидкой питательной среде.

В бактериологические пробирки разливают по 4,5 мл стериль­ного МПБ; в первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, затем готовят его десятикратные разведения от 10~' до Ю-'0. К разведениям бактериофага добавляют по капле суточной бульон­ной культуры чувствительного к данному фагу вида бактерий, инкубируют при 37 °С 24 ч. За титр фага принимают его макси­мальное разведение, еще способное вызвать лизис бактерий — среда в пробирке прозрачна. Фаг считают активным при титре 10-7, 10-8

Рис. 47. Схема строения фага Т2 по данным электронной микроскопии: а — с нуклеиновой кислотой в головке: 1 — головка; 2— полая центральная часть; 3 — оболочка (расправленная); 4— базальная пла­стинка; б —без нуклеиновой кислоты в го­ловке: I — головка; 2 — оболочка (сокрашенная); 3 — хвостовые нити

Определение количества бактериофага (по методу Грациа). Го­товят десятикратные разведения исследуемого фага в физиологи­ческом растворе (10-1…10-2 и т.д.), затем из последнего разведе­ния, например 10-7 или 10-8, берут 0,5 мл жидкости, смешивают с равным объемом чувствительной к данному бактериофагу буль­онной культуры бактерий. Полученную смесь добавляют к 4 мл расплавленного 0,7%-го МПА (температура 45 °С), перемешива­ют и выливают на поверхность подсушенного питательного агара в чашку Петри. Аналогичным образом поступают со всеми разведениями бактериофага (10-5, 10-5 и т.д.). Чашки инкубируют в термостате при 37 ºС 24 ч.

 

 

 

Учет результатов: не пораженные бактериофагом бактерии ра­стут и образуют сплошной газон на поверхности питательного агара. Клетки, пораженные фагом, лизируются, и в этой зоне можно видеть «стерильные» пятна на сплошном бактериальном газоне. Количество этих пятен («бляшек») соответствует количе­ству фаговых частиц в суспензии (рис. 48).

 

 

Применение фагов для идентификации бактерий. Фаги приме­няют для видовой идентификации бактерий (возбудитель сибир­ской язвы, листериоза и др.) или внутривидовой — установление фаговара конкретного бактериального штамма.

Для идентификации неизвестной культуры бактерий при по­мощи диагностического бактериофага обычно используют плот­ную питательную среду. Например, исследуемую 18-часовую культуру, предположительно листерий, засевают в МПБ с глюко­зой, инкубируют при 37 °С 4 ч до легкой опалесценции среды и затем засевают газоном (0,1мл) на подсушенный 2%-й МПА в чашку Петри. Через 1... 1,5 ч инкубирования посевов при 37 ºС при слегка приоткрытой крышке на одну половину газона нано­сят каплю листериозного бактериофага 2А и на вторую половину помещают каплю фага 4А. Посевы инкубируют при 22...25 °С 16...24ч.

Учет результатов: если культура листериозная, то на месте нане­сения хотя бы одного фага можно видеть прозрачную зону лизиса.

Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты дан­ного вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен данный штамм, что и служит его маркером.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Определить активность лечебно-профилактического коли-па-ратифозного фага по отношению к исследуемой культуре Е. coli.

2. Провести идентификацию культуры L. monocytogenes при помощи листериозных диагностических фагов.

Контрольные вопросы

1.Что такое бактериофаг?

2.Как используют бактериофаги?

3.Какими методами титруют бактериофаги?

 






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 524. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.027 сек.) русская версия | украинская версия