Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Антибиотики. Эти вещества, образуемые бактериями, грибами, растениями, животными тканями, способны убивать микроорга­низмы или подавлять их рост




Антибиотики. Эти вещества, образуемые бактериями, грибами, растениями, животными тканями, способны убивать микроорга­низмы или подавлять их рост. Абсолютное большинство извест­ных антибиотиков получают из актиномицетов. Бактерии синте­зируют такие антибиотики, как полимиксины, грамицидины, бацитрацин, гризин. Из грибов выделены пенициллины, цефалоспорины, фумагиллин, гризеофульвин, из животных тка­ней — эритрин, экмолин, из высших растений — аллицин и др. Часть антибиотиков получают химическим синтезом (левомицетин), а большинство — биосинтезом. Активность препаратов оп­ределяют бактериологическими или физико-химическими мето­дами. Биологическую активность антибиотиков выражают в ус­ловных единицах действия — ЕД. За 1 ЕД принимают специфи­ческую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата, но для бензил пенициллина 1 ЕД равна 0,5988 мкг химически чистой натриевой соли препарата. Активность товарных антибиотиков чаще всего выражают в мкг активного вещества, содержащегося в 1 мг препарата.

Успех лечения инфекционных заболеваний человека и живот­ных зависит от выбора эффективного лекарственного средства с учетом чувствительности к нему возбудителя болезни. Материал для лабораторного исследования следует брать до лечения антимикробными препаратами. Чувствительность микроорганизма к антибиотикам определяют с чистой культурой возбудителя.

Методы определения чувствительности микроорганизмов к анти­биотикам. К ним относят метод диффузии в агар, метод серий­ных разведений (на жидкой и плотной питательных средах) и ускоренные методы.

Метод диффузии в агар (метод бумажных дисков). Это наибо­лее простой в исполнении метод. В качестве питательной среды применяют МПА, агар на переваре Хоттингера с содержанием 120...140мг% аминного азота (рН 7,2...7,4) или агар фирмы «Дифко». Диски с антибиотиками (диаметр 5...6 мм) готовят из специальных сортов фильтровальной бумаги. Каждый диск со­держит определенное количество антибиотика, которое указано на этикетке флакона. Во флакон насыпают силикагель, который впитывает влагу и служит индикатором: при переувлажнении ме­няет окраску с синей на розовую. При изменении окраски силикагеля во флаконе диски для использования непригодны. Флако­ны с дисками хранят при температуре 4...20 "С.

Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри по 20 мл (толщина слоя 4...5 мм). Перед посевом чашки со сре­дой досушивают в термостате. Для посева используют суточную бульонную культуру или смывы суточной агаровой культуры. 1 мл микробной суспензии в физиологическом растворе (кон­центрация клеток 109/мл) наносят на агар и покачиванием чаш­ки распределяют по поверхности питательной среды. Избыток жидкости удаляют стерильной пастеровской пипеткой. Засеян­ные чашки Петри подсушивают при комнатной температуре 30...40 мин, а затем на поверхность среды стерильным пинцетом накладывают, плотно прижимая, диски с разными антибиоти­ками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашки. Чашки с дисками выдерживают в термостате при 37 °С 18 ч в положении вверх дном.

Антибиотик из диска диффундирует в агар, вызывая гибель чувствительных бактерий, формируя таким образом вокруг диска зону отсутствия роста (рис. 49). Ближе к диску концентрация ан­тибиотика в агаре выше, по мере удаления от диска концентра­ция снижается. Следовательно, чем больше диаметр зоны задер­жки роста вокруг антибиотика, тем более чувствительна к нему исследуемая культура.

Диаметр зоны задержки (отсутствия) роста микроорганизмов измеряют с помощью линейки или миллиметровой бумаги с точ­ностью до 1 мм. Отсутствие зоны задержки роста микроорганиз­мов вокруг диска указывает на устойчивость исследуемой культу­ры к данному антибиотику. При зоне задержки роста до 14 мм говорят о малой чувствительности к антибиотику, от 15 до 25 мм — о достаточной чувствительности, свыше 25 мм — о высо­кой чувствительности.

 
 

а — к пенициллину; б— к стрептомицину; в — к неомицину; /—зона задер­жки роста (стерильная зона); 2 — сплошной рост бактерий на поверхности питательной среды; 3 — бумажный диск с антибиотиком

 

 

Чтобы получить более точные результаты исследования, необхо­димо соблюдать стандартные условия при постановке опыта. Для проверки точности и стандартности определения чувствительности к антибиотикам Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) реко­мендует контролировать диски на эталонных штаммах микроорга­низмов, которыми служат три культуры из Американской коллекции типовых культур или из Национальной коллекции типовых культур в Англии: S. aureus (АТСС 25923, №СТС 6571), E. coli (АТСС 25922, № СТС 10418), P. aeruginosa (АТСС 27853, № СТС 10662).

Метод серийных разведений. Для проведения опыта готовят ос­новные растворы антибиотиков, используя стандарты антибио­тиков. На этикетке ампулы со стандартом указана концентрация антибиотика в ЕД/мл или мкг/мл. Навески бензил пенициллина калиевой или натриевой соли, ампициллина тригидрата, оксациллина натриевой соли, цефалотина, цефалексина растворяют в 1/15M фосфатном буфере. Основные растворы тетрациклиновых антибиотиков готовят на 0,01 н. растворе соляной кислоты. Для приготовления основных растворов нео-, моно-, канамицина ис­пользуют дистиллированную воду. Концентрация основных ра­створов антибиотиков 1000 мкг/мл.

Метод серийных разведений на жидкой питательной среде: при определении чувствительности к антибиотикам для основной массы микроорганизмов использу­ют МПБ или бульон на переваре Хоттингера, для стрептококков в среду добавляют 1 % глюкозы, для патогенных грибов исполь­зуют среду Сабуро.

Агаровые или бульонные культуры микроорганизмов предва­рительно разводят физиологическим раствором до концентрации клеток 5 • 106/мл.

Схема опыта приведена в таблице 2.

Учет результатов: наименьшее количество антибиотика, даю­щее визуально полную задержку роста (бульон прозрачный), со­ответствует минимальной подавляющей концентрации препара­та (МПК). Минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) определяют высевом на плотные питательные среды из последних прозрачных пробирок, которые предварительно встряхивают. Наименьшее количество антибиотика в пробирке, содержимое которой после инкубирования в течение 24...72 ч не дало роста бактерий при высеве на питательную среду, принима­ют за МБцК.

Метод серийных разведений на плотной питательной среде: для определения чувствительности к антибиотикам большинства микроорганизмов используют МПА или агар на переваре Хоттингера с содержанием аминного азота 120...140мг/мл, рН 7,2...7,4. Приготовленный основной ра­створ антибиотиков разводят в плотной питательной среде. Для этого к расплавленному и охлажденному до 55 ºС агару, разлито­му в широкие пробирки по 18 мл, добавляют по 2 мл соответству­ющего разведения определенного антибиотика, тщательно пере­мешивают и переливают в стерильную чашку Петри. После зас­тывания агара чашки Петри подсушивают в течение 1 ч. Конт­рольные чашки Петри с агаром не содержат антибиотика. Все чашки Петри делят на сектора, каждый из которых засевают ис­следуемой культурой. Посев делают бактериологической петлей из микробной суспензии с концентрацией клеток 106...107/мл. Чашки помещают в термостат при 37 ºС на 20...24 ч.

Наименьшую концентрацию антибиотика, при которой на­блюдают полную задержку роста бактерий на агаре или рост еди­ничных колоний, принимают за МПК препарата. В том случае, когда рост культуры отсутствует на всех чашках, кроме конт­рольной, считают, что исследуемые концентрации антибиотиков превышают МПК препарата. Если на всех чашках отмечают рост культуры, это значит, что микроорганизм устойчив ко всем кон­центрациям антибиотика.

ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Определить чувствительность культуры стафилококка к анти­биотикам методом бумажных дисков.

Контрольные вопросы

1.Что такое антибиотики?

2.Как используют антибиотики в ветеринарии?

3.Какими методами определяют чувствительность микроорганизмов к анти­биотикам?

4.Что принимают за минимальную подавляющую концентрацию антибиотика?

 






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 328. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.005 сек.) русская версия | украинская версия