Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ГЕНЕТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ




Цель занятия. Ознакомить студентов с фенотипической и генотипической изменчивостью и генетическими методами иден­тификации микроорганизмов.

Оборудование и материалы. Культура Proteus vulgarus, пробирки с 2%-м МПА, 1%-й раствор фенола, пробирки с 10 мл и с 1 мл МПБ, чашки Петри с 3%-м МПА, содержащим 100 ЕД стрепто­мицина в 2 мл среды, чашки Петри с обычным МПА, стерильные мерные пипетки на 1 мл, диссоциирующая культура Е. coli или P. multocida на МПА в чашках Петри в виде изолированных коло­ний, бинокулярная лупа МБС-1, культура Е. coli, продуцирующая колицин, и колицинчувствительная культура Е. coli, чашки Пет­ри с 1,5%-м МПА, хлороформ, пробирки с 0,7%-м МПА, штам­мы Е. coli K12F-, lew, strr, Е. coli К12 Hfr, leu+, strs, E. coli lac-, трансдуцирующий фаг λ dgal, содержащий β-галактозидазный оперон Е. coli; набор компонентов для ПЦР-диагностики какой-либо инфекционной болезни, амплификатор.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Генетика микроорганизмов. Природа изменений свойств мик­роорганизмов может быть наследственной (генотипической) и ненаследственной (модификационной, фенотипической).

Модификационная изменчивость. В отличие от мутаций затра­гивает сразу большое количество клеток в популяции.

Модификации — это ненаследуемые фенотипические измене­ния, которые возникают под влиянием различных факторов, но после прекращения их действия исчезают. При этом клетки с одинаковым генотипом могут различаться по фенотипу.

Генотипическая изменчивость. Может быть мутационной, обусловленной изменениями в ДНК под влиянием мутагенов, и комбинативной, связанной с процессом образования новых ком­бинаций генов в генотипе.

Мутации проявляются фенотипически в виде изменения какого-либо признака, присущего микроорганизму, — физиологи­ческого, морфологического. Различают индуцированные и спон­танные мутации. Последние возникают под влиянием неустанов­ленных факторов и достаточно редки в популяции (1 • 10-5...1*10-7).

Рекомбинации — обмен генетическим материалом между двумя бактериальными клетками. Клетку, воспринимаю­щую генетический материал, называют реципиентом, отдаю­щую — донором. Рекомбинантные клетки содержат в составе своего генома фрагменты хромосомы донора. Механизм проник­новения донорской ДНК в клетку реципиента может быть разли­чен: 1) трансформация — «голая» ДНК проникает в клетку реци­пиента без взаимного контакта клеток; 2) трансдукция — перенос фрагментов ДНК из клетки донора в реципиентную клетку уме­ренным бактериофагом; 3) конъюгация — перенос фрагмента ДНК при непосредственном контакте клеток донора и реципи­ента. В процессе конъюгации из одной клетки в другую может переходить плазмидная ДНК. Плазмида (F-фактор) представляет собой внехромосомные небольшие кольцевые молекулы ДНК разной длины. Плазмиды обычно обозначают по характерному свойству клетки-хозяина: R-фактор — плазмида, обеспечиваю­щая устойчивость к лекарственным препаратам, Соl-фактор — плазмида, детерминирующая синтез клеткой антибиотикоподоб-ных веществ (колицинов, бактериоцинов) и т. д.

Выявление модификационной изменчивости. В пробирку с 6 мл расплавленного МПА добавляют 0,6 мл 1%-го раствора фенола, агар скашивают. В пробирки с фенолизированным и обычным МПА засевают культуру Proteus vulgaris по методу Шукевича в конденсационную воду. Посевы инкубируют при 37...38 °С 24 ч и учитывают характер роста протея на фенолизированном и обыч­ном МПА. На фенолизированном агаре протей в отличие от обычного МПА не проявляет феномена «роения».

Выявление мутационной изменчивости во флуктуационном тес­те Лурия—Дельбрюка. Данный тест используют для изучения природы возникновения различных свойств у бактерий: устойчи­вости к бактериофагу, лекарственным препаратам, способности расщеплять углеводы и т. д. В соответствии с гипотезой адапта­ции каждая клетка в популяции в присутствии того или иного фактора — фага, антибиотика и т. д. — может с некоторой долей вероятности приобрести устойчивость к нему (адаптироваться). Согласно гипотезе спонтанных мутаций каждая клетка бактерий также с небольшой долей вероятности может приобрести устой­чивость к тому или иному фактору в результате мутаций незави­симо от присутствия этого фактора в среде обитания.

С помощью флуктуационного теста Лурия—Дельбрюка можно подтвердить мутационную природу возникшего свойства.

Готовят два ряда культур.

1. «Параллельные» культуры: в пробирку, содержащую 10 мл МПБ (обозначим ее № 1), и в 10 пробирок, содержащих по 1 мл МПБ (№2...11), одновременно высевают одинаковое количество клеток Е. coli (300...500 бактериальных клеток на пробирку). По­севы инкубируют при 37 °С 24 ч.

2. «Независимые» культуры: в 20 чашек Петри разливают МПА с добавлением стрептомицина (конечная концентрация антибиотика 100 ЕД на чашку). Первые 10 чашек засевают по 0,1 мл культурой, взятой из пробирки № 1; следующие 10 чашек засевают по 0,1мл культурами, взятыми из пробирок №2...11. Посевы инкубируют при 37 ºС 24 ч. После инкубирования под­считывают число выросших колоний на всех чашках Петри с «параллельными» и «независимыми» культурами.

На стрептомициновом агаре давать колонии могут только ус­тойчивые к стрептомицину клетки Е. coli.

Примерно одинаковое число колоний на всех чашках (нет статистически достоверных отличий) подтверждает теорию адап­тации. Если же на чашках, засеянных культурами из пробирок №2...11, наблюдают существенную разницу в числе колоний, а на чашках, засеянных культурой из пробирки № 1, нет статисти­чески достоверных отличий, то можно говорить о мутационной природе наблюдаемой стрептомицинустойчивости. Мутации — редкое событие, и при посеве из отдельных пробирок мутанты вырастают только в некоторых чашках. При посеве же из общей пробирки предсуществующие мутанты будут равномерно распре­делены в жидкой среде и соответственно в чашках с агаром.

Диссоциация бактерий.Диссоциация — это появление в бакте­риальной популяции колоний различного типа: S-формы (smooth — гладкий), R-формы (rough — шероховатый), что может быть следствием мутаций или рекомбинаций.

Для бактерий в S-форме характерны типичные для вида морфо­логические, ферментативные и вирулентные свойства. У R-формы обычно отмечают меньшую вирулентность, потерю способности к капсулообразованию, нередко изменение ферментативных свойств. Анализ популяции бактериальных штаммов по признаку диссоциации с целью отвивки (селекции) S-формы — обязатель­ный этап при работе с производственными штаммами. В ходе та­кой селекции ориентируются на морфологические и оптические характеристики S- и R-колоний.

Для анализа популяции бактерий с признаками диссоциации (Е. coli, P. multocida) производят дробный рассев исследуемой культуры на МПА в чашки Петри с целью получения изолиро­ванных колоний. Посевы культивируют при 37...38 °С 18...24 ч. Чашку Петри с колониями помещают на предметный столик би­нокулярной лупы и изучают в косопроходящем пучке света (см. тему 8).

Дополнительно из колоний S- и R-формы делают окрашен­ные мазки и изучают особенности морфологии клеток.

Выявление бактериальной плазмиды Со1+ (по методу отсрочен­ного антагонизма Фредерик). Исследуемую культуру Е. coli засева­ют уколом в 1,5%-й МПА (обычно 6...8 штаммов на одну чашку). Посевы инкубируют при 37 °С 48 ч. Выросшие колонии убивают парами хлороформа, затем поверхность агара заливают слоем расплавленного и охлажденного до 46...48 ºС 0,7%-го агара, сме­шанного с 0,1 мл 6-часовой бульонной культуры Е. coli, чувствительной к колицинам. Через 24 ч инкубирования при 37 ºС вок­руг колоний, продуцирующих колицин, можно видеть зоны по­давления роста колицинчувствительной (индикаторной) куль­туры.

Демонстрация специфической трансдукции. Для проведения опыта необходимы: реципиентный штамм Е. coli lac-, не способ­ный ферментировать лактозу, трансдуцирующий фаг λ dgal, ге­ном которого содержит β-галактозидазный оперон Е. coli.

Смешивают 1 мл 3-часовой бульонной культуры Е. coli и 1 мл фага с титром 10-6...10-7, смесь инкубируют при 37 °С 1 ч. Затем из смеси готовят десятикратные разведения в пробирках. Из про­бирки с разведением 10-6 высевают в три чашки Петри с агаром Эндо по 0,1мл культуры. Посевы инкубируют при 37 ºС 24 ч. Подсчитывают лактозонегативные и лактозопозитивные (транс -дуктанты) колонии. Соотносят число трансдуктантов к числу ко­лоний реципиентного штамма (светлые, лактозонегативные ко­лонии) и определяют таким образом частоту трансдукции. На­пример, выросло 6 колоний красного цвета (трансдуктанты) и 468 светлых колоний (реципиентные), следовательно, частота трансдукции составляет 6/468 = 1,3 * 10-2.

Демонстрация конъюгации. Для проведения опыта необходи­мы: реципиентный штамм Е. coli K12F-, leu-, Strr; донорский штамм Е. coli К12, Hfr, leu+, Strs; минимальная синтетическая сре­да для обнаружения рекомбинантов (сульфат железа — 0,0005 г, глюкоза — 2 г, сульфат аммония — 1 г, сульфат магния — 1 г, ди-гидрофосфат калия —6,5 г, нитрат кальция — 0,001 г, стрептоми­цин — 200 ЕД/мл, вода дистиллированная — 1000 мл), аналогич­ная питательная среда без стрептомицина; полноценный пита­тельный агар со стрептомицином.

В пробирке объединяют 3-часовые бульонные культуры реци­пиентного и донорского штаммов в соотношении 2:1, смесь вы­держивают при 37 °С 30 мин, разводят стерильным физиологи­ческим раствором в соотношении 1 : 100 и по 0,1 мл высевают на минимальную селективную среду (агаровую). Посевы инкубиру­ют при 37 °С 18...20 ч, затем учитывают рост колоний эшерихий. На этой среде могут расти только клетки рекомбинантов, соеди­нившие в себе устойчивость к стрептомицину (свойство реципи­ента) и отсутствие зависимости от лейцина (свойство донора). Для отрицательного контроля на минимальную селективную сре­ду высевают культуры донорского и реципиентного штаммов (не должны расти). Для положительного контроля донорский штамм высевают на селективную среду без стрептомицина, а реципиен­тный штамм — на полноценный питательный агар со стрептоми­цином (эшерихий должны расти на обеих средах).

Если определить количество жизнеспособных клеток реципи­ентов в посевном материале и соотнести их с количеством рекомбинантных клеток, то можно рассчитать частоту рекомбина­ции (см. «Демонстрацию специфической трансдукции»).

Генетические методы идентификации микроорганизмов. Фенотипические признаки бактерий отражают максимум 20 % геноти­па, поэтому ученые интенсивно разрабатывают методы и крите­рии идентификации микроорганизмов, основанные на изучении не фенотипического проявления генома, а особенностей строе­ния ДНК.

Сравнение геномов по составу основания ДНК.ДНК содержит четыре азотистых основания: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц). По правилам спаривания оснований А = Т и Г = Ц, но молярное отношение (Г + Ц): (А + Т) варьирует у разных ви­дов и может служить таксономической характеристикой.

Поскольку число водородных связей между основаниями в парах ГЦ больше, чем между основаниями в парах AT, то о ГЦ-содержании судят по «температуре плавления» ДНК, т. е. по тем­пературе, при которой происходит разрыв водородных связей, со­единяющих цепи ДНК. Разделению цепей сопутствует увеличение оптической плотности, которую измеряют спектрофотометром при А = 260 нм (максимум поглощения ДНК). По мере нагревания образца ДНК поглощение возрастает и, когда ДНК становится одноцепочечной, кривая поглощения достигает плато.

У каждого бактериального вида ДНК содержит характерное среднее количество ГЦ, и если нуклеотидный состав ДНК у двух сравниваемых микроорганизмов существенно отличается(10...15 %), то говорят об их принадлежности к различным таксо­номическим группам. Однако отсутствия существенных отличий в количестве ГЦ у двух видов бактерий недостаточно для заклю­чения о тождестве этих бактерий: необходимо доказать высокое фенотипическое сходство обоих видов или применить другие ге­нетические методы.

Метод гибридизации нуклеиновых кислот. Основан на том, что одноцепочечная ДНК после тепловой денатурации при пониже­нии температуры на 20...30 °С ниже температуры плавления спо­собна реассоциироваться (отжиг) в изначальную двухцепочечную ДНК. Также был установлен факт реассоциации одноцепочечных ДНК от различных видов бактерий с образованием гибрид­ной ДНК, причем чем больше гомология сравниваемых одноцепочечных ДНК, тем успешнее реассоциация. Аналогичным обра­зом можно проводить гибридизацию между РНК и ДНК, тРНК и рРНК.

При проведении гибридизации ДНК один из сравниваемых образцов денатурированной ДНК метят радиоактивным изото­пом, образовавшиеся двухцепочечные ДНК отделяют от одноцепочечных и измеряют их радиоактивность. В качестве контроля используют меченую и немеченую ДНК эталонного (известного) штамма микроорганизма. Степень реассоциации таких гомоло­гичных одноцепочечных ДНК принимают условно за 100%. Су­ществует точка зрения, что при 60... 100 % гомологии ДНК можно говорить о принадлежности сравниваемых бактерий к одному виду, при 40...60 % — к одному роду, при 0...25 % гомологии — к родам одного семейства и разным семействам.

Метод генных зондов. Используют достаточно часто для идентификации бактерий. От обычной ДНК—ДНК гибридиза­ции этот способ отличается использованием не тотальной ДНК, а определенного ее фрагмента (зонда), содержащего из­вестный ген (генетический маркер). Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериаль­ную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фрагменты ДНК раз­деляют электрофоретически, методом трансформации опреде­ляют их генетические характеристики, отбирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрированным изве­стным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое количество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмидную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, затем эту меченую ДНК гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Ме­тодом ауторадиографии выявляют относительную частоту гиб­ридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генетическом родстве известной (бактерии — донора ДНК) и исследуемой бактерий.

Полимеразная цепная реакция — ПЦР (polymerase chain reaction — PCR). Принцип реакции состоит в том, что при помо­щи ДНК-полимеразы in vitro многократно синтезируют копии определенного участка ДНК (амплификация — накопление).

ПЦР — циклический процесс, каждый цикл которого включа­ет в себя три стадии.

1. Проводят тепловую денатурацию (95 °С) исследуемой ДНК. При этом разрушаются водородные связи, соединяющие парные основания, и цепи ДНК расходятся, т. е. образуются одноцепо-чечные ДНК, которые доступны для праймеров (затравок) и ДНК-полимеразы. Длительность процесса 1 мин.

2. Осуществляют посадку (отжиг) праймеров на комплемен­тарные участки двух антипараллельных цепей ДНК. Праймеры представляют собой два синтетических олигонуклеотида длиной в 20...30 нуклеотидов, каждый из которых комплементарен про­тивоположной цепи ДНК в участках, ограничивающих выбран­ный сегмент ДНК возбудителя. Таким образом, праймеры огра­ничивают специфический для возбудителя участок ДНК. Прай­меры добавляют в реакционную смесь в избытке, что позволяет им занять свои комплементарные участки до того, как произой­дет соединение (ренатурация) одноцепочечных ДНК в двухцепо-чечную. Длительность стадии 1...2мин.

3. Идет процесс достройки (элонгации) праймера из вне­сенных в реакционную смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов при участии ДНК-полимеразы. Используют обычно термоста­бильную ДНК-полимеразу термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза), что позволяет вести полимериза­цию при оптимальной температуре 70...75 °С. При синтезе ДНК праймеры включаются в ее молекулу. Синтез ДНК с по­мощью полимеразы протекает только между праймерами, и при этом удваивается число копий именно этого участка ДНК. Молекула ДНК, синтезированная при помощи одного прайме­ра, может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК при помощи другого праймера. Длительность этой ста­дии 1...2 мин (рис. 50).

По завершении 1-го цикла реакцию тормозят и ДНК вновь подвергают температурной денатурации. При охлаждении избы­точные праймеры опять гибридизируются с цепями исходной и вновь синтезированной ДНК. Добавление ДНК-полимеразы обеспечивает второй цикл полимеризации. Таким образом мож­но провести несколько десятков циклов ферментативного удли­нения праймеров, в результате количество сегментов ДНК, огра­ниченных с обеих сторон праймерами, с каждым циклом увели­чивается экспоненциально. Следовательно, используя метод ПЦР, можно in vitro избирательно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион раз и более. Факт увеличения числа фрагментов ДНК служит доказательством присутствия в исследуемом образце гомологичной ДНК, т. е. возбудителя инфекционной болезни.

Для практического использования ПЦР необходимо синтези­ровать праймеры, комплементарные З'-концам цепей копируе­мой ДНК-матрицы и ограничивающие копируемый фрагмент ДНК. Их выбирают на основе участков генома возбудителя с рас­шифрованной нуклеотидной последовательностью и устойчивых к генетическим перестройкам. Например, для идентификации C.psittaci были предложены праймеры, выбранные на основе гена, кодирующего белок наружной мембраны, или на основе гена, кодирующего 16s рРНК; для идентификации бруцелл был выбран праймер на основе гена, кодирующего белок внешней мембраны 31 КДа, и т. д.

 

 

Для проведения ПЦР-диагностики необходимы следующие компоненты: водные растворы дезоксинуклеозидтрифосфатов четырех типов (gATO, gTTO, glTO, gHTO, 10 мМ, рН 7,0); пер­вый праймер (5 мМ); второй праймер (5 мМ); фермент Taq-поли-мераза (5 ЕД/мкл); амплифицируемая ДНК (~ 1 мкг); ионы Mg2+ для обеспечения работы полимеразы (25 мМ); буферный раствор (десятикратный концентрат), например, трис-соляная кислота (рН 6,8...7,8) с добавлением бычьего альбумина и неионных де­тергентов.

Указанные компоненты объединяют в пробирке, например, в следующих количественных соотношениях: раствор дезоксинук­леозидтрифосфатов — 8 мкл, буфер—10мкл, амплифицируемая ДНК — ~ 1 мкг, праймеры — по 1...5 мкл, полимераза — 0,5 мкл, дистиллированная вода — до 100 мкл. Для предотвращения испа­рения на жидкость в пробирке наслаивают минеральное масло. На первом этапе проведения ПЦР денатурируют ДНК, затем в реакционную смесь, содержащую дезоксинуклеозидтрифосфаты, вносят полимеразу и помещают в амплификатор или термоцик-лер (программируемый термостат). Амплификацию проводят в термоциклере по заданной программе, например: 90 "С — 1 мин; 60 °С - 1 мин; 72ºС - 1 мин (5 циклов); 93 °С - 1 мин; 57 °С -1 мин; 92 °С — 1 мин (5 циклов); 93 °С — 1 мин; 55 °С — 1 мин; ,72 °С — 3 мин (25 циклов).

После завершения амплификации следует этап обнаружения продуктов ПЦР — амплификонов. Молекулы ДНК и их фрагмен­ты разделяют электрофорезом в агаровом геле. ДНК в геле окра­шивают бромидом этидия с последующим анализом и фотогра­фированием фореграмм при ультрафиолетовом облучении. Спе­цифичность полосы амплифицированной ДНК подтверждают сравнением с маркерными фрагментами и ДНК-стандартом. До­полнительно специфичность амплификона можно подтвердить путем гибридизации со специфическим радиоактивным зондом.

Объектом исследования в ПЦР могут служить как ткани, со­держащие возбудитель, так и культуры возбудителя. Из материа­ла обычно тем или иным способом извлекают ДНК. В зависимо­сти от характера материала методы его обработки варьируют.

Ценность ПЦР-диагностики возрастает, когда необходимо обнаружить возбудителей инфекционных болезней, или трудно культивируемых, или находящихся в нетипичной форме (L-формы бактерий), а также выявить гены, контролирующие тот или иной фактор патогенности микроорганизма.

 

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Изучить и охарактеризовать рост культуры протея на обыч­ном и фенолизированном МПА.

2. Определить природу возникновения стрептомицинрезистентных форм Е. coli по результатам флуктуационного теста Лурия—Дельбрюка.

3. Ознакомиться с диссоциацией бактерий. Описать особен­ности морфологии S- и R-колоний и бактериальных клеток из них.

4. Ознакомиться с бактериоциногенией (способность выде­лять антибиотикоподобные вещества) на примере колицинов Е. coli.

5. Проанализировать результаты опытов по конъюгации,
трансдукции и трансформации бактерий.

6. Изучить схему проведения ПЦР, реагенты, аппаратуру.

 

Контрольные вопросы

1.Какие известны формы изменчивости бактерий?

2.В чем состоит тест Лурия—Дельбрюка?

3.Какова роль плазмид в формировании патогенных свойств бактерий?

4.Какие генотипические методы применяют для идентификации бактерий?

 


Раздел II

ИНФЕКЦИЯ И МЕТОДЫ ПРИКЛАДНОЙ ИММУНОЛОГИИ

 






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 370. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.091 сек.) русская версия | украинская версия