Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ВИРУЛЕНТНОСТИ И ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ





Цель занятия. Ознакомить студентов с техникой заражения лабораторных животных, целями и правилами их бактериологи­ческого исследования. Освоить методы определения вирулентно­сти микроорганизмов и тестирования факторов патогенности бактерий.

Оборудование и материалы. Кровяной МПА в чашках Петри, стерильная плазма кролика (человека), культуры Е. coli, трупы мышей, зараженных Е. coli, белые мыши, морские свинки, кро­лики, стерильные шприцы, иглы, физиологический раствор.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Экспериментальное заражение лабораторных животных (био­проба). Этот метод применяют для выделения из исследуемого материала возбудителя болезни, испытания патогенности изучае­мого микроорганизма, определения эффективности вакцин, им­мунных сывороток и т. д.

О патогенности микроорганизма судят по его способности вызывать заболевание или гибель зараженного животного, а так­же по отдельным факторам патогенности (косвенные признаки).

Для заражения используют лабораторных животных разных видов (мышей, белых крыс, морских свинок, кроликов, голубей и др.). Выбор животного зависит от его чувствительности к иссле­дуемому виду микроорганизма. В отдельных случаях заражают естественно-восприимчивых животных (свиней, крупный рога­тый скот, овец и т. д.). Если изучают выделенную культуру мик­роорганизма, то для заражения берут 18...24-часовую агаровую или бульонную культуру. При заражении животных исследуемым материалом (ткани органов, гной, слизь, кровь и т. д.) последний предварительно растирают в ступке со стерильным физиологи­ческим раствором. Для опыта берут животных, одинаковых по массе и возрасту.

Перед заражением животных метят: кроликов и морских сви­нок — металлическими ушными номерами; мышей и крыс — ра­створом краски (фуксин, метиленовый синий и т.д.). Для удоб­ства и безопасности работы животных фиксируют. Морских сви­нок помощник держит брюшком вверх так, чтобы средний палец левой руки находился на шее, а большой и указательный — у передних конечностей животного. Правой рукой придерживают задние конечности. Мышь берут одной рукой за кончик хвоста, другой — за кожную складку затылка и поворачивают в нужное положение. Крыс фиксируют корцангами, захватив складку кожи затылка, плотно прижимают голову к поверхности стола, другой рукой держат за хвост и поворачивают в нужное положение, от­тягивают корцангом голову (рис. 51...53).

Методы заражения животных. При заражении используют только стерильные инструменты — шприцы, иглы, ланцеты, пинцеты и др.

Скарификация (накожное заражение): на месте зара­жения предварительно выстригают шерсть и дезинфицируют кожу, затем скальпелем делают небольшие надрезы кожи (насеч­ки) и в них втирают жесткой щеточкой исследуемый материал или бактериальную культуру.

Внутрикожное заражение: пальцами левой руки оттягивают кожу и в образовавшуюся между ними кожную склад­ку вводят кончик иглы. Объем вводимого материала не должен превышать 0,2 мл. Показатель правильного введения — припух­лость размером с горошину.

Подкожное заражение: пальцами левой руки оття­гивают кожу, в образовавшийся «кармашек» — складку вводят иглу шприца, затем его содержимое. Место заражения у кроли­ков — со стороны спины, несколько сбоку, у белых мышей и крыс — со спины к основанию хвоста. Объем вводимого матери­ала не должен превышать для мышей 1 мл, для крыс, морских свинок — 10 мл, кроликов — 20...25 мл.

Внутримышечное заражение: материал чаще вводят с внутренней поверхности бедра. Голубей и кур заражают также и в грудную мышцу. Объем вводимого материала мышам 0,5 мл, морским свинкам и крысам по 3...5 мл, кроликам 5...8 мл, большие дозы следует вводить дробно в два-три места.

Внутрибрюшинное (интраперитонеальное) зара­жение: животное фиксируют головой вниз, иглу шприца вво­дят в нижнюю треть живота, чуть отступя от белой линии. Доза не должна превышать 0,1...0,2 мл.

Внутривенное заражение: исследуемый материал вводят кроликам в краевую вену уха, мышам и крысам — в вену хвоста. Перед заражением место инъекции протирают тампоном, смоченным ксилолом или теплой водой, чтобы вызвать наполнение сосудов кровью.

 
 

 

 

Интрацеребральное заражение: животных фик­сируют в положении на спине. У кроликов трепанируют череп на участке между надбровным углом и черепным гребнем. Выстрига­ют шерсть и дезинфицируют кожу, пальцами левой руки растяги­вают ее над глазницей параллельно черепному гребню и рассекают (края раздвигают), крестообразно разрезают надкостницу, малень­ким трепаном прокалывают осторожно черепную кость, осторож­ным поворотом выпиливают диск и этот небольшой кусочек кости извлекают. Шприцем вводят 0,2 мл исследуемого материала. Пос­ле этого осторожно соединяют края надкостницы, кожную рану закрывают тампоном и заливают коллодием. У мышей и крыс тре­панацию не делают, а легким проколом костной ткани черепа вво­дят кончик тонкой иглы и инъецируют материал.

Интраназальное заражение: животное предва­рительно слегка наркотизируют, прикладывая к носу вату, смо­ченную эфиром, затем с помощью глазной пипетки вводят мате­риал.

Оральное заражение: исследуемый материал добав­ляют в корм, воду или вводят через небольшой зонд.

Кроме того, животных заражают в переднюю каме­ру глаза.

Бактериологическое исследование трупа животного. Проводят с целью выделения чистой культуры микроба при диагностических исследованиях либо для подтверждения специфической природы гибели животного при заражении чистой культурой микроорга­низма.

Трупы животных вскрывают, соблюдая правила асептики. Тело животного фиксируют в положении на спине на доске или в кювете с парафином. Кожно-шерстный покров дезинфицируют 5%-м раствором фенола или лизола. Разрезают кожу по белой линии от промежности до грудинно-ключичного сочленения. За­тем кожу отделяют от мышц, делают поперечные надрезы и кож­ные лоскуты отводят в сторону. Пинцетом захватывают мечевид­ный отросток, под ним надрезают мышцы, ножницами с обеих сторон рассекают ребра, грудину откидывают кверху.

Сначала вскрывают грудную полость. Учитывают патолого- анатомическую картину, записывают данные в журнале экспер­тизы. Поверхность сердца, легких, лимфатических узлов прижи­гают раскаленным шпателем, пастеровской пипеткой прокалы­вают в этом месте орган, насасывают небольшое количество кро­ви (тканевой пульпы) и высевают ее на питательные среды, соблюдая стерильность (рис. 54).

Затем вскрывают брюшную полость. Пинцетом оттягивают вверх брюшную стенку и ножницами разрезают ее от диафрагмы до анального отверстия (важно не повредить кишечник!). Осматривают органы брюшной полости, отмечая размеры, цвет и кон­систенцию паренхиматозных органов, состояние кишечника, на­личие экссудата в брюшной полости и его характер. Также после прижигания поверхности делают посевы из печени, почек, селе­зенки, лимфатических узлов, в случае необходимости из содер­жимого кишечника и других органов. Параллельно из тканей ор­ганов готовят мазки-отпечатки для микроскопического исследо­вания: стерильными ножницами отрезают кусочек органа и к по­верхности разреза несколько раз отдельными участками прикладывают предметное стекло; препарат подсушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают, микроскопируют.

По аналогичной схеме исследуют трупы и других эксперимен­тально зараженных животных, а также отдельные органы и ткани сельскохозяйственных животных (патологический материал), по­ступающие в лабораторию для исследования. При работе с тру­пами соблюдают меры, предупреждающие распространение воз­будителя инфекции. После окончания исследования кюветы, доски, рабочий стол дезинфицируют. Инструменты стерилизуют. Трупы животных и отдельные органы обеззараживают автоклавированием или сжигают в трупосжигательной печи.

Определение вирулентности и токсигенности микроорганизмов. В повседневной диагностической практике обычно ограничиваются установлением факта патогенности микроорганизма; при оценке биопрепаратов необходимы количественные характеристики ви­рулентности микроорганизма, взятого для заражения животного.

Вирулентность (токсигенность) микроба измеряют в специальныx условных единицах: абсолютная летальная доза (Dсl — dosis certae letalis) вызывает гибель 100 % зараженных животных; 50%-я летальная доза (LD50) — 50 % зараженных животных; 50%-я инфицирующая доза (ID50) вызывает заболевание 50% заражен­ных животных. LD50 и ID50 —наиболее точные показатели, по­скольку отражают чувствительность к возбудителю (токсину) большинства взятых в опыт животных, a Del показывает чувстви­тельность наиболее устойчивых особей.

Для расчета LD50 исследуемой культуры микроорганизма ис­пользуют один из приведенных методов. Готовят суспензию бак­терий с известным содержанием микробных клеток в единице объема. Затем делают последовательные (2, 5, 10-кратные) разве­дения суспензии на стерильном физиологическом растворе и рав­ные объемы каждого разведения вводят (подкожно, внутрибрю-шинно и т. д.) чувствительным лабораторным животным. Если оп­ределяют летальный эффект, то учитывают количество погибших животных и рассчитывают LD50. Поскольку обычно ни одна из доз возбудителя не приводит к гибели строго 50 % зараженных живот­ных, LD50 определяют статистическими методами.

Расчет LD50 по методу Рида и Мета. Например, из суспензии с концентрацией клеток 109/мл были приготовлены десятикрат­ные разведения Ю-2, Ю-3 и т.д. По 0,5мл каждого разведения ввели внутрибрюшинно шести белым мышам. Результаты зара­жения показаны в таблице 3.

 

В графах 3 и 4 приведены фактические цифры гибели живот­ных, зараженных различными дозами возбудителя. В графах 5 и 6 указаны так называемые кумулятивные данные. Например, в графе 5 напротив дозы 10-2 стоит число 14, оно получено из предположения, что при заражении всех мышей одной этой до­зой (максимальной) пали бы все животные, которые погибли после введения меньших доз (10-3, 10-4 и т.д.). Поэтому мы име­ем формальное право суммировать напротив дозы 10-2 в графе 5 всех мышей, павших от этой и меньших доз: 6 + 5 + 2 + 1 = 14 мышей. Аналогичным образом определяем кумулятивные дан­ные в графе 5 напротив каждой дозы Таким же образом определяем кумулятивные данные для всех доз по графе 6 (выжившие животные). Например: при заражении мышей минимальной дозой 10-6 выжило 6 мышей и, безусловно, выжили бы все животные, которые остались живы после зараже­ния большей дозой бактерий. Исходя из этого, кумулятивный показатель при дозе 10-6 составляет: 6 + 5 + 4+1 = 16 мышей. Аналогичным образом определяем это число для остальных доз.

На следующем этапе, основываясь на кумулятивных данных, рассчитывают процент гибели мышей при заражении каждой до­зой микроорганизма. Как видно, ни одна доза не приводит к гибели 50 % мышей, и этот показатель рассчитывают математи­чески.

В нашем случае LD50 находится между дозами 10-3 и 10-4, не­много ближе к 10-4. Маленькую разницу (от 37,5 до 50 %) соотне­сем с большей (от 88,8 до 37,5 %) и получим фактор пропорцио­нальности, на который доза 10-4 отличается от LD50. Этот фактор умножаем на логарифм разведения, который в нашем примере равен 1,0 (фактор = 10, lg 10 = 1,0). Эту величину вычитаем из 10-4 и получаем LD50:

50-37 5=12 5

------- ----- —=0,243 (фактор пропорциональности);

88,8—37,5=51,3

0,243-1 =0,243; 4,0-0,243 = 3,756.

Следовательно, LD50=10-3,756. Чтобы найти разведение бакте­риальной суспензии, соответствующее вычисленному показате­лю LD50, используют логарифмические таблицы. Антилогарифм и одновременно искомое разведение составляют 1 : 5747. Для за­ражения животных использовали суспензию бактерий с концент­рацией клеток 109/мл в объеме 0,5 мл, следовательно, LD50 = 109 0,5/5747 = 87 000 микробных клеток.

Расчет LD50 по методу Кербера. Для получения точных резуль­татов необходима положительная ответная реакция в диапазоне от 100 до 0 %.

Рассмотрим пример расчета на основании тех же данных, ко­торые приведены в таблице 3.

 

 

Сумму констант (2,32) рассматривают как характеристику процесса в целом. Логика дальнейших рассуждений следующая.

Из суммы 2,32 вычитаем значение константы, соответствую­щей 50%-й реакции (0,5): 2,32 - 0,5 = 1,82. На степень 1,82 пока­затель LD50 отличается от 100%-й реакции.

Число 1,82 умножаем на значение логарифма интервала меж­ду разведениями исходной бактериальной суспензии, а посколь­ку разведения десятикратные, то получим

1,82 - 1,00= 1,82.

Далее суммируем 1,82 с показателем степени разведения сус­пензии (1/102), при котором константа реакции равна 1,0: 1,82 + 2,0 = 3,82, т. е. LD50 = 10-3,82 Все это можно выразить следующей формулой:

LD50 = lgl/102 + lg 10 (Е-0,5),

где lg 1/102 — логарифм разведения с константой реакции 1,0; lg 10 — логарифм ин­тервала (кратность разведения может быть 2, 5 и т. д.); X — сумма констант реак­ций.

Используя таблицу антилогарифмов, показатель 10-3,82 пере­водят в абсолютную величину.

Выявление токсинов микроорганизмов. Обнаружение экзоток­синов лежит в основе лабораторной диагностики многих инфек­ционных заболеваний (ботулизма, энтеротоксемии овец и др.), а также микотоксикозов. В этих случаях материал, предположи­тельно^ содержащий токсин, вводят (скармливают, наносят на поверхность кожи) чувствительным биологическим моделям (ла­бораторные, сельскохозяйственные животные и др.) и по их ги­бели, заболеванию, изменениям в органах и тканях судят о нали­чии токсина. Разработаны иммунологические методы идентифи­кации токсинов (см. тему 19).

Кроме того, обнаружение токсинов и определение их количе­ства необходимы для приготовления биопрепаратов. Например, иммунитет при ботулизме, энтеротоксемии в значительной мере антитоксический, присутствие токсина (в виде анатоксина) в вакцине определяет иммуногенность препарата. Поэтому необ­ходимо точно определять количество токсина в культуральной жидкости. В этом случае устанавливают содержание токсина в 1 мл культуральной жидкости на чувствительных животных, рас­считывая LD50, например, по методу Кербера.

Выявление других факторов патогенности микроорганизмов. Заключение о патогенности микроорганизма делают как по ре­зультатам биопробы (прямое доказательство), так и по ряду при­знаков, косвенно свидетельствующих о патогенных свойствах выделенного микроба. Наиболее часто применяют следующие тесты.

Тест на плазмокоагулазу. Коагулаза — фермент бактерий (стафилококков), который в сочетании с некоторыми компонентами сыворотки коагулирует плазму. Благодаря коагу-лазе вокруг стафилококковых поражений образуется фибриноз­ный барьер, облегчающий персистенцию бактерий в тканях, кро­ме того, отложения фибрина на поверхности бактериальных кле­ток затрудняют их фагоцитоз.

Петлю бактериальной массы исследуемой культуры, снятой с поверхности агаровой среды, смешивают с 0,5 мл плазмы крови кролика (человека), не разведенной или разведенной стериль­ным физиологическим раствором в соотношении 1 : 4, инкубиру­ют при 37 ºС, результаты учитывают через 4 и 24 ч. Положитель­ная реакция — образование сгустка.

Тест на гиалуронидазу. Гиалуронидаза — фер­мент, расщепляющий гиалуроновую кислоту и, как следствие, деполимеризующий межклеточное вещество. Рассматривают как фактор инвазивности бактерий. Получение гиалуронового суб­страта (из пупочных канатиков) — довольно сложная процедура. На практике удобнее использовать тест декапсуляции бактерий. В качестве субстрата в этом случае берут культуры бактерий, в капсульном веществе которых есть гиалуроновая кислота (P. multocida серовар A, S. equi).

На поверхность агара в чашке Петри дробно засевают культу­ру P. multocida или S. equi. Затем в виде линии высевают на поверхность среды культуру микроорганизма, у которого выявля­ют способность к синтезу гиалуронидазы. Чашки с посевами ин­кубируют при 37 °С 16...24 ч. Если исследуемый микроорганизм выделяет гиалуронидазу, то она диффундирует в толщу питательной среды и разрушает капсулу тест-микроба. При анализе посе­вов в косопроходящем пучке света колонии S. equi (P. multocida) вблизи «штриха» исследуемой культуры меньше по размеру, се­рого или голубого цвета в отличие от флуоресцирующих отдален­ных колоний.

Тест на гемолизин. Бактериальные гемолизины — обширная группа веществ-мембранотоксинов, которые вызыва­ют нарушение целостности мембраны эритроцитов и их лизис.

Исследуемую культуру уколом или дробно засевают в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром, посевы инкубируют при 37 °С 24 ч. Гемолизин, выделяемый растущей культурой бактерий, диффундирует в толщу агара и вызывает лизис эритроцитов, что проявляется в виде светлой (бета-гемолиз) или полупрозрачной (альфа-гемолиз) зоны вокруг колоний. Гемолитическую актив­ность микроорганизма можно также определять его посевом в 1 ...5%-й кровяной бульон, который после культивирования вы­деляющего гемолизин микроба становится прозрачным за счет лизиса эритроцитов.

Тест на фибринолизин (стрептокиназу). Многие гемолитические стрептококки образуют стрептокиназу, которая активирует протеолитический фермент плазмы (плазминоген → плазмин), этот фермент — фибринолизин растворяет коагулиро­ванную плазму.

Исследуемую культуру микроорганизма засевают в виде «бляшки» на агар с 12% цитрированной плазмы. Посевы инку­бируют при 37 ºС 23...24 ч. Положительный результат — появле­ние зоны просветления вокруг колонии.

Тест на лецитиназу. Лецитиназа расщепляет гидро­лизом лецитин. Готовят желточный агар: пептон — 20 г, гидро­фосфат натрия — 2,5 г, натрий — 1 г, 0,5%-й раствор сульфата магния — 0,1 мл, глюкоза—1 г, агар—12,5 г, вода дистиллиро­ванная — 500 мл. Устанавливают рН 7,2...7,4, стерилизуют при 121 °С 15 мин, охлаждают до 55 ºС, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь раз­ливают в чашки Петри.

Исследуемую культуру засевают дробно на желточный агар, культивируют при 37...38 °С 24...48 ч. Положительный резуль­тат — появление зоны помутнения вокруг колоний.

Тест на ДНК-азу. Исследуемую культуру бактерий засевают «штрихом» на питательный агар с ДНК и культивируют при 37 °С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. раствор соляной кислоты. Положитель­ный результат — при гидролизе ДНК вдоль «штриха» культуры видна светлая зона.

Питательная среда с ДНК: в расплавленный МПА добавляют 10%-й раствор ДНК до конечной 0,2%-й концентрации, переме­шивают компоненты, автоклавируют при 120 °С 15 мин и разли­вают в чашки Петри.

Тесты на другие ферменты. Как факторы патогенности можно рассматривать ферменты, катализирующие ре­акции с образованием токсических продуктов, например: уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака; декарбоксилаза декарбоксилирует аминокислоты с образованием аминов и т.д. Методы обнаружения этих ферментов изложены в теме 9.

Тест на адгезины. В адгезии бактерий принимают участие различные компоненты оболочки. Это свойство выявля­ют по способности исследуемого микроорганизма сорбироваться на различных эукариотических клетках (эритроциты, энтероциты) или других частицах (латекс). Еще один метод обнаружения адгезинов связан с их использованием в качестве антигенов в се­рологических реакциях. У эшерихий адгезивные свойства часто определяют по их способности агглютинировать эритроциты.

В лунки планшетов вносят по 50 мкл 4%-й суспензии отмытых эритроцитов морской свинки, 1%-й раствор D-маннозы, суспен­зию исследуемых бактерий с концентрацией клеток 109/мл. Па­раллельно ставят реакцию в отсутствие маннозы. Результат учи­тывают через 30...60 мин. Положительная реакция — склеивание и оседание эритроцитов в виде «зонтика». Торможение агглюти­нации маннозой обозначают как маннозочувствительную ГА (гемагглютинация), отсутствие ингибирования — как маннозорезистентную ГА.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Освоить методы заражения лабораторных животных.

2. Провести бактериологическое исследование трупа лабора­торного животного.

3. По готовым цифровым данным рассчитать LD50 микроорга­низма.

4. Ознакомиться с проявлением гемолитической, плазмокоа-гулазной, гиалуронидазной активности микроорганизмов.

Контрольные вопросы

1. Какими методами заражают лабораторных животных?

2. Каковы основные правила бактериологического исследования трупов живот-
ных?

3.С какой целью и какими методами рассчитывают LD50 микроорганизмов?

4.Какими методами определяют факторы патогенности микроорганизмов?

 






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 2751. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.021 сек.) русская версия | украинская версия