Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Тема 18




МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА). ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Цель занятия. Ознакомить студентов с принципом метода флуоресцирующих антител и техникой постановки реакции иммунофлуоресценции, с принципом и техникой проведения им-муноферментного анализа.

Оборудование и материалы. Инактивированные культуры бруцелл и сальмонелл, 96%-й этанол, ФСБР (рН 7,2...7,4), «влажная камера» (чашки Петри, эксикатор), люминесцирующие сыворот­ки против бруцелл, сальмонелл, иммуноглобулинов кролика, по­зитивная бруцеллезная сыворотка, готовый препарат для демон­страции результатов ИФА, люминесцентный микроскоп.

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

В названных серологических реакциях используют антитела (иммунные сыворотки), меченные флуорохромом или фермента­ми, и в дальнейшем, применяя специальные методы, регистри­руют образование комплекса антиген — антитело. В некоторых вариантах ИФА ферментную метку вводят в антиген.

Метод флуоресцирующих антител (МФА). Этот комплексный метод сочетает в себе серологическую реакцию, при которой происходит специфическое взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, и микроскопическое ис­следование, с помощью которого этот комплекс обнаруживают.

В реакции иммунофлуоресценции используют антитела, к ко­торым присоединен флуорохром (чаще флуоресцеин — изотиоцинат). Такие антитела сохраняют способность специфически реагировать с антигеном и благодаря флуорохрому светиться под воздействием ультрафиолетовых лучей. При постановке МФА микробный антиген фиксируют на предметном стекле и обраба­тывают люминесцирующими антителами. Затем препарат отмы­вают водой от несвязавшихся антител и просматривают в люми­несцентном микроскопе. Если антитела специфически соответ­ствуют данному антигену, то они образуют с антигеном прочный комплекс и при люминесцентной микроскопии в препарате об­наруживают светящиеся микробные клетки (рис. 70).

Преимущество МФА как диагностического метода состоит в том, что с его помощью возможно за два-три часа серологически идентифицировать микроорганизм непосредственно в патологи­ческом материале, без выделения в чистой культуре (экспресс-метод). Как и другие серологические реакции, МФА применяют и для выявления антител в крови животных.

Приготовление препарата для МФА. При выявлении возбуди­теля инфекции (антигена) на предметном стекле готовят мазки-отпечатки из органов или другого материала. Чтобы обнаружить антитела в исследуемой сыворотке крови, на предметном стекле готовят мазки из известного антигена, например возбудителя сальмонеллеза, сибирской язвы и др. Препарат с нанесенным материалом (бактериальная суспензия, мазок-отпечаток) подсу­шивают на воздухе и фиксируют ацетоном (5 мин), или этанолом (10.... 15 мин), или метанолом (5...10 мин). Препарат можно фик­сировать и нагреванием, как при обычной световой микроско­пии. Мазки-отпечатки из органов и тканей лучше обрабатывать охлажденным до -20 °С ацетоном 2...4 мин. В зависимости от конкретных задач окрашивание готовых препаратов люминесци­рующими сыворотками проводят различными способами.

Прямой МФА. Разработал Coons с соавт. (1950). На предмет­ное стекло с фиксированным антигеном наносят каплю люминесцирующей иммунной сыворотки в рабочем разведении, со­держащей антитела против искомого антигена. Чтобы избежать высыхания, препарат помещают во влажную камеру (чашку Пет­ри) с фильтровальной бумагой, смоченной водой, и выдержива­ют в термостате при 37...38 °С 15...30 мин. Затем препарат 5... 10 мин промывают от несвязавшихся иммуноглобулинов про­точной (водопроводной) водой с рН не ниже 7,0. Промытый пре­парат высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Прямой МФА используют только для идентификации неизве­стного антигена; к его недостатку относят необходимость приго­товления люминесцирующей сыворотки для каждого вида иден­тифицируемого микроорганизма.

Непрямой МФА.Применяют в двух вариантах.

Двухступенчатый МФА предложили Weller и Coons (1954). Этот вариант считают более универсальным, так как при помощи одной люминесцирующей антивидовой сыво­ротки можно выявлять различные виды микроорганизмов.

На антиген наносят каплю немеченной иммунной сыворотки (сыворотка первой ступени). Препарат выдерживают в термоста­те 15...30 мин, затем его промывают, чтобы удалить несвязавшиеся антитела иммунной сыворотки, и просушивают (см. прямой вариант). Если антитела сыворотки первой ступени соответству­ют антигену, то вода не вымывает образовавшийся АГ—АТ-комплекс (антитела зафиксированы на антигене).

На подсушенный препарат наносят каплю люминесцирую­щей антивидовой сыворотки (сыворотка второй ступени) в ра­бочем титре. Препарат повторно помещают в термостат во влажной камере на 15...30 мин, затем промывают водой и под­сушивают. Антивидовая сыворотка представляет собой мечен­ные флуорохромом антитела против иммуноглобулинов крови животного того вида, от которого получена иммунная сыворот­ка первой ступени. Таким образом, антитела первой сыворотки служат антигеном для меченых антител антивидовой сыворот­ки. В результате к образовавшемуся на первом этапе АГ—АТ-комплексу присоединяются антитела второй ступени, образует­ся двойной комплекс, который можно обнаружить в люминес­центном микроскопе.

Универсальность непрямого варианта обусловлена тем, что, используя на первом этапе полученные от животных одного вида (например, от лошадей) иммунные сыворотки против различных микроорганизмов, на втором этапе с помощью одной антивидо­вой сыворотки можно идентифицировать неограниченное коли­чество возбудителей инфекционных болезней.

Трехступенчатый МФА представляет собой вари­ант РСК на стекле. В данном случае в иммунном комплексе на стекле при помощи люминесцирующей сыворотки выявляют связанный комплемент (рис. 71).

Двухступенчатым или трехступенчатым МФА при использова­нии известного антигена можно обнаруживать антитела в крови животных.

Для подтверждения специфичности результатов МФА необхо­димы контроли. Для прямого варианта достаточно одного конт­роля: гомологичные и гетерологичные в антигенном отношении микроорганизмы обрабатывают люминесцирующей сывороткой. В первом случае наблюдают свечение бактерий, во втором свече­ние отсутствует.

Для непрямого варианта ставят два контроля: 1) мазки, содер­жащие гомологичные и гетерологичные в антигенном отноше­нии микроорганизмы, обрабатывают антивидовой люминесциру­ющей сывороткой. При отсутствии антител первой ступени клет­ки не должны люминесцировать; 2) мазки с гомологичными и ге-терологичными в антигенном отношении бактериями обра­батывают иммунной (антимикробной) сывороткой (первый этап) с последующим нанесением флуоресцирующей антиглобулино-вой (антивидовой) сыворотки (второй этап). Специфическое све­чение бактерий наблюдают в первом случае, во втором оно от­сутствует.

Оценка результатов МФА. Учитывают яркость свечения, цвет, локализацию и структуру свечения. У бактерий, окрашенных (обработанных) люминесцирующей сывороткой, меченной изоцианатом флуоресцеина, обычно наблюдают яркое зеленое све­чение по периферии клетки в виде ободка или ореола, централь­ная часть бактерий светится слабо. Такой характер свечения объясняют тем, что с единицы площади по периферии микроб­ной клетки на сетчатку глаза наблюдателя проецируется в не­сколько раз больше антител, чем с центральной ее части. Следует учитывать, что у пластичных бактерий (лептоспиры, вибрионы) светится вся клетка. У клеток, погруженных в тканевую жид­кость, и у молодых бацилл сибирской язвы контур обычно выражен нерезко.

Интенсивность свечения оценивают по четырехкрестовой си­стеме: 1) (++++) — очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с темной централь­ной частью клетки; 2) (+++) — яркая флуоресценция периферии клетки; 3) (++) — слабое свечение периферии клетки; 4) (+) — нет контрастного свечения периферии и центральной части мик­робной клетки. Отсутствие специфического свечения обозначают знаком «минус» (видны тени микроорганизмов). При диагности­ке различных возбудителей болезней положительным результа­том чаще считают специфическое свечение бактериальных кле­ток не ниже, чем на четыре или три креста.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Этот метод получил рас­пространение после того, как была решена задача введения фер­ментной метки в молекулы антител или антигенов. Антитела, связанные с ферментом, сохраняют способность специфически реагировать с гомологичным антигеном, а фермент — взаимодей­ствовать с соответствующим субстратом.

ИФА обычно используют в гистохимическом (иммунопероксидазная реакция) и твердофазном вариантах.

Гистохимический ИФА. При помощи этого метода обычно об­наруживают микробные антигены в мазках-отпечатках, мазках крови, гистосрезах. Как и в случае МФА, пероксидазную реак­цию используют в прямом и непрямом вариантах.

Прямая иммунопероксидазная реакция. В качестве известного компонента используют, меченные пероксидазой антитела против какого-либо патогенного микроорганизма. Препарат, например мазки-отпечатки, фиксируют охлажден­ным ацетоном (-15...-20 °С), подсушивают, наносят четыре-пять капель конъюгата в рабочем титре (меченые антитела), инкуби­руют во влажной камере при 37 °С 1...2ч, промывают физиологи­ческим раствором 15 мин, ополаскивают дистиллированной во­дой, подсушивают, наносят на препарат несколько капель ра­створа субстрата (25 мг 3,3-ДАБ • 4НС1 растворяют в 100 мл 0,05 М трис-буфера с рН 7,5 и 25 мл этого раствора объединяют с 3 мл 0,5%-го раствора перекиси водорода). Препарат с субстра­том выдерживают 5...10 мин, промывают в физиологическом ра­створе 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой и микро­скопируют.

Если в исследуемом материале присутствует искомый микроб­ный антиген, то меченные пероксидазой антитела с ним специфически связываются. Внесение субстрата к пероксидазе приво­дит к образованию цветного продукта, видимого при микроско­пии сначала как гранулы голубого, а позднее желто-коричневого цвета.

Непрямая иммунопероксидазная реак­ция. Как и в МФА, используют меченные пероксидазой анти­тела иммуноглобудинам определенного вида животных. На первом этапе фиксированный охлажденным ацетоном препарат с исследуемым материалом обрабатывают во влажной камере при 37...38 ºС 1...2 ч. иммунной сывороткой (0,2...0,3 мл), содержащей немеченые антитела к искомому антигену. Затем препарат про­мывают физиологическим раствором 5 мин, подсушивают и об­рабатывают при 37...38 °С 1...6ч во влажной камере антителами, меченными пероксидазой (конъюгат в рабочем разведении). Последующие операции и учет результатов аналогичны прямому варианту пероксидазной реакции.

Твердофазный ИФА. Применяют наиболее широко. В этом слу­чае антитела или антигены фиксируют на нерастворимых носи­телях: микропанелях, стеклянных или нейлоновых шариках.

При различных вариантах реакции результаты учитывают ин­струментально или визуально.

Обнаружение антигена по схеме «сэндвич» состо­ит из следующих этапов.

Лунки полистироловых микропанелей, сенсибилизируют спе­цифическими для искомого антигена антителами[2] в концентра­ции 10...30 мкг/мл. Обычно в лунку вносят по 0,2 мл раствора ан­тител в буфере с рН 9,6, выдерживают при 37 °С 1 ч и затем ос­тавляют на ночь при 4 "С. Удаляют раствор иммуноглобулинов панели промывают ФСБР (рН 7,4) три раза, чтобы удалить избы­ток свободных (несорбированных) антител.

В лунки вносят по 0,2 мл раствора, содержащего исследуемый антиген, и инкубируют при 37°С 2 ч, затем панели вновь промы­вают, как ранее описано.

В лунки вносят по 0,2 мл меченных ферментом специфичес­ких антител (конъюгат); панели инкубируют при 37 °С 1...2ч, затем их отмывают от несвязавшихся антител.

В лунки вносят 0,2 мл раствора ферментного субстрата [ортофенилендиамин (ОФД) или

5-аминосалициловая кислота — для пероксидазы и р-нитрофенилфосфат — для щелочной фосфатазы] и инкубируют в темноте при 20...22 ºС 5...30 мин.

Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 н. раствора серной кислоты (для пероксидазы) и 3 М раствора гидроксида натрия (для щелочной фосфатазы).

Учет результатов визуальный или спектрофотометрический по увеличению поглощения при длине волн 490 нм (пероксидаза) или 405 нм (щелочная фосфатаза). Субстрат ОФД: положитель­ный результат — оранжево-коричневое окрашивание. Субстрат 5-аминосалициловая кислота: положительный результат — ин­тенсивное коричневое окрашивание.

За положительный результат принимают превышение оптической плотности опытных образцов над контрольными в пять-шесть раз.

Обнаружение антител (в сыворотке крови) осно­вано на том же принципе, но твердофазный носитель сенсиби­лизируют известным антигеном, обрабатывают исследуемой сы­вороткой, затем антивидовым иммуноглобулином, меченным ферментом. Вносят субстрат и по цветной реакции судят о нали­чии или отсутствии антител в исследуемой сыворотке крови.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Идентифицировать культуры возбудителей бруцеллеза и сальмонеллеза прямым МФА.

2. Идентифицировать двухступенчатым МФА культуру саль­монелл.

3. Изучить микроскопическую картину при учете результатов гистохимического ИФА (иммунопероксидазный тест).

Контрольные вопросы

1. В чем сущность одноступенчатого, двухступенчатого и трехступенчатого МФА?

2.Для каких целей используют МФА?

3.Какие разработаны варианты ИФА?

 






Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 238. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.085 сек.) русская версия | украинская версия