Студопедия — Задание 2. Приготовление фиксированных мазков из культур простейших и окрашивание по Романовскому-Гимзе
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Задание 2. Приготовление фиксированных мазков из культур простейших и окрашивание по Романовскому-Гимзе






На предметном стекле готовят фиксированный мазок чистой или накопительной культуры простейших, окрашивают по Романовскому-Гимзе или фуксином. Микроскопируют с иммерсионной системой.

Контрольные ВОПРОСЫ

1. Какие морфологические особенности грибов позволяют их дифференцировать от других микроорганизмов при микроскопировании?

2. На каких биологических особенностях основана классификация грибов?

3. Какие методы микроскопического исследования используют при изучении патогенных микроскопических грибов? Какими красителями окрашивают препараты?

4. Какие морфологические особенности простейших используют для микроскопической диагностики?

5. Какие препараты готовят при микроскопировании простейших и почему?

6. Какие красители используют при приготовлении препаратов простейших?


Раздел 2. культивирование
микроорганизмов и выделение чистых
культур

2.1. Культивирование микроорганизмов. Питательные среды

Цель занятия

Познакомиться с условиями культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях и с ассортиментом питательных сред, освоить методы приготовления питательных сред, поставить опыт по получению накопительных культур микроорганизмов.

Основные сведения

Культивирование микроорганизмов

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов и понимании значения физико-химических условий среды, необходимых для их жизнедеятельности. В лабораторных условиях микроорганизмы культивируют на питательных средах.

Условия культивирования микроорганизмов

Для роста микроорганизмов существенное значение имеет не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.

Активная кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растут при рН, близком к 7, 0. Микроскопические (плесневые и дрожжевые) грибы предпочитают слабокислые среды. Поэтому в приготовленных средах всегда следует определять значение рН. В случае необходимости кислотность среды доводят до нужного значения растворами кислот, щелочей или солей, имеющих кислотную реакцию (Na2CO3, NaHCO3). Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе культивирования микроорганизмов. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды. Чтобы избежать этого, в среды добавляют буферные растворы (чаще фосфатные) или избыточное количество мела.

Аэрация. Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки всегда в больших количествах. Однако значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода (группа облигатных аэробов). Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствие кислорода (облигатные анаэробы). Существует также переходные группы микроорганизмов по потребности в кислороде.

Для выращивания аэробных форм микроорганизмов чаще всего используется метод поверхностного культивирования на плотных и жидких питательных средах. Питательные среды разливают тонким слоем в посуду с широким дном, обычно в чашки Петри. Для получения аэробного роста в большом объеме жидкой среды требуется дополнительная аэрация. Для этого используются различные устройства, обеспечивающие постоянное перемешивание среды путем встряхивания или вращения сосудов. Можно пропускать стерилизованный воздух через жидкость под давлением с помощью пористых разбрызгивателей или обеспечивать механическое перемешивание специальными механизмами.

Для роста строго анаэробных микроорганизмов нужно исключить попадание кислорода в среду инкубации. Для этого среды перед посевом кипятят, посевы выдерживают в герметически закрытых сосудах или в специальных вакуумных анаэростатах, из которых с помощью насосов выкачивается воздух, или воздух в них заменяется каким-нибудь инертным газом (например, азотом). В анаэростат можно добавлять различные вещества, поглощающие кислород – щелочной пирогаллол, хлорид одновалентной меди и др. Кроме того используют разные приёмы: выращивание в высоком слое среды; культивирование в вязких средах; выращивание в толще плотной среды.

При культивировании автотрофных микроорганизмов, использующих в качестве источника углерода углекислый газ, добавляют в среду NaHCO3.

Температура. Интервал температур, в которых возможен рост различных микроорганизмов, заметно варьируется. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам микроорганизмов, температурный оптимум лежит в интервале от 25 до 37º С. У термофилов он значительно выше: от 45 до 80–90º С. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5–10º С. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влияют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращивают в термостатах или специальных термостатированных комнатах, где с помощью терморегуляторов поддерживается соответствующая температура. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

Вода. Рост микроорганизмов невозможен без присутствия в окружающей среде воды, причём вода должна находиться в доступной для клетки форме, то есть в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молекулами растворённых веществ и не может быть использована микроорганизмами. Различную активность воды в питательной среде создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, KCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленгликоль.

Пищевые потребности микроорганизмов и требования
к питательным средам

Для выделения, выращивания и длительного сохранения микроорганизмов в культурах используют различные питательные среды, содержащие все вещества, необходимые для их роста. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Однако выделяют основные группы необходимых питательных веществ.

1. Источники углерода. По потребности в углероде микроорганизмы принято делить на автотрофы и гетеротрофы. Автотрофные микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода использовать углекислый газ. Для культивирования автотрофов в среды вносят бикарбонат натрия или карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, обогащённый 1–5 % углекислого газа. Для культивирования гетеротрофов среда должна содержать органические вещества – кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения.

2. Источники азота. Потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями. Для очень многих микробов это могут быть неорганические соединения – соли аммония, нитраты. Потребности других микроорганизмов в азоте удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка или аминокислоты. Наиболее требовательные микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления – пептоны, представляющие собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотистых оснований, солей и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздействия протеолитических ферментов на белки животного или растительного происхождения.

3. Минеральные соли. Микроорганизмам для построения веществ клетки кроме углерода и азота необходимы также сера, фосфор и ряд других элементов. Все они должны содержаться в среде в доступной форме. Потребности в этих элементах обычно удовлетворяются за счёт минеральных солей – сульфатов, фосфатов и хлоридов магния, кальция, натрия, железа и др.

4. Микроэлементы. Потребности микроорганизмов в микроэлементах (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт) очень малы. Питательные среды с пептоном, почвенной вытяжкой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом казеина содержат необходимые микроэлементы. В состав синтетических сред микроэлементы необходимо дополнительно вносить.

5. Факторы роста. Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста, к которым относятся витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания. Чтобы подчеркнуть потребность микробов в факторах роста, принято использовать термины прототрофы и ауксотрофы. Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или несколько факторов роста. Примерами смесей, содержащих различные факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт.

Существует ряд требований, предъявляемых к питательным средам:

1. среды должны содержать полный набор необходимых питательных веществ;

2. среды должны быть изотоничными (для большинства микроорганизмов концентрация солей не должна превышать 0, 5 %);

3. кислотность среды должна быть нейтральной или слабощелочной (pН=6–8). В процессе культивирования микроорганизмов в среду могут выделяться метаболиты, изменяющие рН среды настолько, что рост микроорганизмов существенно замедляется или даже становится невозможным. Чтобы избежать изменения рН, в среду добавляют буферные системы, чаще фосфатные (они малотоксичны для микроорганизмов и используются ими также в качестве источника фосфора);

4. среды должны быть стерильными.

Классификация питательных сред

При культивировании микробов готовят питательные среды такого состава, который наилучшим образом соответствует требованиям той или иной физиологической группы микробов или проявлению их определенных свойств в зависимости от поставленной цели. Поэтому для выделения и изучения свойств микроорганизмов применяется большое количество сред, различающихся по происхождению, консистенции, составу и назначению.

а) В зависимости от происхождения среды подразделяются на:

- натуральные, представляющие собой естественные субстраты (молоко, мясной бульон, сыворотка крови, настой почвы и сена, картофельный отвар, солодовое сусло и др.);

- полусинтетические, состоящие из различных отваров и настоев растительного или животного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ (мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар);

- синтетические, состоящие из химически чистых веществ (солей, углеводов, аминокислот, витаминов и др.), взятых в определенных соотношениях.

б) По консистенции различают:

- жидкие питательные среды (бульоны), состоящие из воды и растворённых в ней веществ;

- плотные питательные среды, готовящиеся путем добавления к жидким среда уплотняющих веществ – желатины (10–15 %) или агар-агара (1–2 %);

- полужидкие питательные среды, содержащие уплотняющие вещества в меньшем количестве (0, 2–0, 3 % агар-агара).

Примечание: Агар-агар–вещество, получаемое из морских водорослей (в переводе с малайского языка – желе). Отвар агар-агара после остывания застывает в виде плотной желеобразной массы и служит для уплотнения питательных сред и продуктов питания.

в) По назначению питательные среды делятся на:

- универсальные, применяющиеся для культивирования большинства микроорганизмов, содержащие триптические гидролизаты мясных и рыбных продуктов, крови животных или казеина. Из них готовят жидкую среду – питательный бульон и плотную – питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления сложных питательных сред – сахарных, кровяных и др.;

- элективные (от латинского electus – избираю) - предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При их составлении исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия; холерного вибриона – в щелочной среде и т.д. К ним относятся среды с сывороткой или кровью для патогенных микроорганизмов; среды Кита-Тароцци и Вильсон-Блера для выращивания патогенных анаэробов;

- дифференциально-диагностические, применяющиеся для различения (дифференциации) отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип составления таких сред основан на различиях в биохимических свойствах вследствие неодинакового набора ферментов. Примером является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы. В ее состав входит лактоза, насыщенный спиртовой раствор фуксина (обесцвеченного перед добавлением в среду 10 % водным раствором сульфата натрия). Кишечная палочка при росте на такой среде ферментирует лактозу с образованием альдегидов. Вследствие этого бесцветная фуксин-сернистая кислота переходит в альдегид-сернистое соединение с образованием фуксина, который окрашивает колонии кишечной палочки в красный цвет с металлическим блеском.

Этапы приготовления питательных сред

1. Согласно прописи в дистиллированную среду вносят необходимые компоненетыи растворяют при нагревании.

2. Определяют рН среды с помощью индикаторных бумажек или электропотенциометров (с учетом того, что после стерилизации рН снизится на 0, 2).

3. Жидкие и желатиновые среды фильтруют через фильтровальную бумагу, среды с агаром (в горячем состоянии) – через ватно-марлевый фильтр.

4. При необходимости питательную среду осветляют обработкой белком куриного яйца, сывороткой или осаждением.

5. Среды готовят в чистой нестерильной посуде, если среда подлежит стерилизации при 120º С; или в стерильной посуде, если среда требует стерилизации при более низкой температуре.

6. Агаровые среды, не содержащие углеводов и нативного белка, и синтетические среды стерилизуют в автоклаве при 115–120º С в течение 15 минут.

7. Среды, содержащие углеводы, молоко, желатин, стерилизуют текучим паром при 100º С дробно или в автоклаве при 112º С в течение 15 минут.

8. Среды, содержащие нативные белок или мочевину, стерилизуют фильтрованием или добавляют стерильные компоненты (кровь, сыворотку и др.) в стерильную основу среды.

9. Готовые стерильные питательные среды подвергают контролю на стерильность путем выдерживания в термостате при 37º С в течение 1–3 сут.

Промышленным способом некоторые среды изготавливаются в виде сухих порошков. Преимущественно таких сред в их стандартности, удобстве при транспортировке. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи, указанной на этикетке. Примеры питательных сред и их состав приведены в Приложении 1.

Содержание лабораторной работы







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 1078. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Кардиналистский и ординалистский подходы Кардиналистский (количественный подход) к анализу полезности основан на представлении о возможности измерения различных благ в условных единицах полезности...

Обзор компонентов Multisim Компоненты – это основа любой схемы, это все элементы, из которых она состоит. Multisim оперирует с двумя категориями...

Композиция из абстрактных геометрических фигур Данная композиция состоит из линий, штриховки, абстрактных геометрических форм...

Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...

Закон Гука при растяжении и сжатии   Напряжения и деформации при растяжении и сжатии связаны между собой зависимостью, которая называется законом Гука, по имени установившего этот закон английского физика Роберта Гука в 1678 году...

Характерные черты официально-делового стиля Наиболее характерными чертами официально-делового стиля являются: • лаконичность...

Этапы и алгоритм решения педагогической задачи Технология решения педагогической задачи, так же как и любая другая педагогическая технология должна соответствовать критериям концептуальности, системности, эффективности и воспроизводимости...

Тактика действий нарядов полиции по предупреждению и пресечению правонарушений при проведении массовых мероприятий К особенностям проведения массовых мероприятий и факторам, влияющим на охрану общественного порядка и обеспечение общественной безопасности, можно отнести значительное количество субъектов, принимающих участие в их подготовке и проведении...

Тактические действия нарядов полиции по предупреждению и пресечению групповых нарушений общественного порядка и массовых беспорядков В целях предупреждения разрастания групповых нарушений общественного порядка (далееГНОП) в массовые беспорядки подразделения (наряды) полиции осуществляют следующие мероприятия...

Механизм действия гормонов а) Цитозольный механизм действия гормонов. По цитозольному механизму действуют гормоны 1 группы...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.012 сек.) русская версия | украинская версия