Определение МПК антимикробных препаратов методом серийных разведений

Номер пробирки	Разведение антибиотика	Концентрация антибиотика, мкг/мл	Рост бактерий (помутнение среды)
	1: 100		_
	1: 200		_
	1: 400		_
	1: 800	12, 5	_
	1: 1600	6, 25	+
	1: 3200	3, 12	+
	Среда без антибиотика (контроль)	_	+

Диапазон серии разведений определяют установленными критериями чувствительности микроорганизма. В приготовленные разведения антибиотика вносят по 0, 1–0, 2 мл суточной бульонной культуры исследуемого микроорганизма в концентрации 10³–10⁵ м/о/мл, перемешивают и термостатируют 18–20 часов при 37º С. Параллельно ставят контрольные пробы: контроль питательной среды и контроль культуры микроорганизмов. После инкубации определяют МПК – концентрацию препарата в последней пробирке с отчетливо видимой задержкой микробного роста. Для уточнения полученного результата содержимое двух последних пробирок с видимой задержкой роста в объеме 0, 5–0, 7 мл высевают на плотные среды в чашки Петри, термостатируют при таких же условиях и отмечают наличие или отсутствие роста.

Контрольные ВОПРОСЫ

1. С какой целью изучают чувствительность микроорганизмов к антимикробным препаратам?

2. Какие методы используют для изучения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам?

3. В чем заключается диффузионный метод? Для каких микроорганизмов он не используется и почему?

4. Что такое МПК? Какими методами можно определить этот показатель?

5. Как оценивают результаты, полученные методом серийных разведений?

6. Какие экспресс-методы используют для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам?

3.4. Изучение патогенности и вирулентности микроорганизмов.
Работа с лабораторными животными

Цель занятия

Знакомство с методами изучения патогенности и вирулентности микроорганизмов, принципами работы с лабораторным животными..

Основные сведения

В основе возникновения и развития инфекционного процесса лежит взаимодействие паразита и хозяина. Последнее включает ряд стадий, в которых микроорганизмы приобретают способность вызывать патологические процессы в организме человека. Патогенность (генетически детерминированная способность вызывать заболевания) является полидетерминантным признаком. Каждый патогенный микроорганизм несет генетическую информацию об образовании различных факторов вирулентности. К основным из них относятся способность синтезировать экзо- и эндотоксины, ферменты агрессии, компоненты микробной клетки. Выявление факторов вирулентности является важным этапом при индикации и идентификации возбудителей заболеваний.

Патогенность и вирулентность микроорганизмов изучают при помощи нескольких методов: бактериоскопических, биохимических, биологических.

Бактериоскопические методы

Бактериоскопическими методами можно установить наличие факторов патогенности – являющихся морфологическими особенностями микроорганизмов или приводящими к их изменению. С их помощью можно обнаружить:

- слизистую капсулу (окрашиванием фиксированных мазков бактерий по методу Омелянского или Бурри-Гинса),

- корд-фактор у микобактерий – возбудителей туберкулеза (окашиванием фиксированных мазков чистой культуры, выращенной в жидкой среде, по Цилю-Нильсену),

- способность бактерий к адгезии (в мазках со слизистых оболочек, окрашенных по Романовскому-Гимзе, содержащих клетки эпителия),

- незавершенный фагоцитоз (в мазках крови или лейковзвеси, окрашенных по Романовскому-Гимзе).

Биохимические методы

С помощью биохимических методов проводят обнаружение экзоферментов -ферментов агрессии и экзотоксинов. Например:

- для обнаружения гиалуронидазы в пробирку с раствором гиалуроновой кислоты вносят культуру бактерий и инкубируют при 37º С 15 минут (параллельно ставят контрольный опыт без внесения бактерий), затем в обе пробирки добавляют 2–3 капли концентрированной уксусной кислоты. Гиалуроновая кислота при добавлении уксусной кислоты образует сгусток. Следовательно, если бактерии выделяют гиалуронидазу, сгусток не образуется, а в контрольной пробирке – образуется;

- плазмокоагулазу выявляют в посевах исследуемой культуры микроорганизмов в стерильную цитратную плазму крови (в контрольном опыте в пробирку помещают только плазму). Посевы инкубируют при 37⁰С 2–5 часов. В случает выработки фермента происходит свертывание плазмы, в контроле она остается жидкой;

- гемолизины обнаруживают в посевах исследуемого микроорганизма на плотные среды с кровью (посевы инкубируют при 37º С в течение суток) по образованию вокруг колоний прозрачных или зеленоватых (неполный гемолиз) зон гемолиза;

- лецитиназу выявляют в посевах микроорганизмов на питательный агар с лецитином. После суточного инкубирования вокруг колоний бактерий, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском;

- для определения цитотоксинов бульонную культуру бактерий вносят в культуру чувствительных клеток. В положительном случае после инкубации наблюдают характерное цитопатическое действие (изменение формы и размеров клетки, появление вакуолей в цитоплазме, нарушение целостности клеточного монослоя).

Биологические методы

Биологическими называются методы исследования, связанные с использованием лабораторных животных. Эти методы используют для оценки вирулентности и токсигенности изучаемых культур микроорганизмов, а также с целью выделения чистой культуры возбудителя, определения активности и безвредности иммунобиологических препаратов, диагностики некоторых инфекционных заболеваний. Широко используются лабораторные животные и в научных исследованиях.

Экспериментальное заражение животных. Все манипуляции с животными проводят с помощью стерильных инструментов с использованием приемов асептики. Животных перед манипуляциями взвешивают, маркируют, фиксируют и обязательно обезболивают. Способ введения материала, содержащего микроорганизмы, выбирают, исходя из цели и тропности возбудителя заболевания. Чаще всего заражение производят с помощью шприца, волосы на месте инъекции сбривают, кожу смазывают дезинфицирующим раствором (спиртом, настойкой йода). Способы заражения:

- подкожно – кроликам и морским свинкам на спине или на боку, несколько ниже подмышечных впадин; крысам и мышам – в области спины, крестца и затылка. Объем вводимой жидкости не более 10 мл для крыс, 1 мл – для мышей;

- внутрикожно – тонкой иглой в кожу спины или живота, объем жидкости не более 0, 1 мл;

- внутримышечно – на участке тела с наиболее развитым мышечным слоем (для большинства животных – наружная верхняя треть бедра задней лапы), объем вводимого материала не более 3 мл для крыс, не более 0, 5 мл – для мышей;

- внутривенно – крысам и мышам в вену хвоста, кроликам – в краевую вену уха;

- внутрибрюшинно – держа животное вниз головой, короткую иглу вводят в нижнюю часть живота перпендикулярно до ощущения «провала». Объем вводимого материала до 5 мл крысам, до 2 мл – мышам;

- через пищеварительный тракт – через металлический зонд или резиновый катетер (диаметр не более 1 мм для мышей и 1, 5 мм – для крыс; длина 35–45 мм и 70–75 мм соответственно);

- интраназально – в состоянии легкого наркоза, тупой иглой небольшими каплями на глубину 1–1, 5 мм мышам (2–3 мм крысам, 4 мм морским свинкам и кроликам);

- внутрь головного мозга – тонкой иглой на уровне средней трети линии, соединяющей внутренний угол глаза с основанием уха. Объем вводимого материала – 0, 1 мл мышам и морским свинкам, 0, 3–0, 5 мл крысам и кроликам.

Умерщвление и вскрытие животных. В лабораторной практике приняты способы умерщвления, которые характеризуются простотой приемов и вызывают быструю смерть животного. Мышей, крыс и морских свинок помещают в герметичный сосуд с кусочком ваты, пропитанной хлороформом или эфиром, животные засыпают и гибнут в течение 3–5 минут. Кроликов умерщвляют путем воздушной эмболии краевой вены уха.

Вскрытие трупов животных производят стерильными инструментами, соблюдая правила асептики, на деревянной доске или в эмалированном лотке с парафиновым слоем на дне. При вскрытии необходимо предупредить внесение микроорганизмов с поверхности в глубину ткани и перенос их с одного органа на другой. Для этого лучше проводить вскрытие непосредственно после смерти животного.

Труп фиксируют брюшком вверх, кожу в месте разрезов освобождают от волос и протирают дезинфицирующим раствором. Порядок вскрытия, описании и посева материалов: наружные покровы – подкожная клетчатка – грудная полость – брюшная полость. По мере вскрытия отмечают состояние органов и тканей, наличие экссудата, абсцессов, гиперемии, ишемии. Для микробиологического исследования делают посевы и мазки подкожной клетчатки, лимфатических узлов, крови из сердца, ткани легких, печени, селезенки, надпочечников, содержимого желудка и кишечника. Изменения, выявленные при вскрытии трупа, и результаты микробиологического исследования вносят в протокол, содержащий следующие пункты: вид лабораторного животного, цель заражения, время заражения (дата, час), материал, использованный для заражения (материал колонии с плотной среды, бульонная культура, взвесь патологического материала и др.); изменение поведенческих реакций животного после заражения, время гибели (дата, час), изменения, обнаруженные при вскрытии трупа в месте введения материала, состояние подкожной клетчатки, лимфоузлов, изменения внутренних органов; материал, взятый для посева; вид микроорганизма, выделенного из трупного материала (основные морфологические, культуральные, биохимические и серологические свойства).

После вскрытия трупы животных помещают в раствор дезинфицирующего средства, после сжигают.

Содержание лабораторной работы