Для этого требуются дополнительные измерения.

Потребуется определить: 1) «константу сосудика»; 2)гематокрит; 3)диэлектрическую проницаемость липидов мембран[2]

Потребуется расчитать: 1)удельное сопротивление дисперсной фазы для всех концентраций и частот и выбрать из полученных значенияпригодные для дальнейших расчетов; 2) электрическую емкость мембран эритроцитов; 3)толщину слоя липидов.

3.1.2.1. определение константы сосудика для всего диапазона частот.

Для студентов забывших увиденное и услышанное в практикуме по физической химии.

а)зачем вообще нужно ее определять и что это такое?

Вообще-то "постоянную сосудика" нужно определять тогда, когда необходимо перейти от относительных измерений электропроводности электролитов (и других жидкостей) к абсолютным значениям измеряемых величин, которые характеризуют ТОЛЬКО ОБЪЕКТ И НЕ ЗАВИСЯТ ОТ ПАРАМЕТРОВ КОНКРЕТНОЙ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЙ ЯЧЕЙКИ (кондуктометрического сосудика).

В этом случае, вместо электропроводности следует определять величину называемую УДЕЛЬНОЙ ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТЬЮ.

Удельная электропроводность это - величина обратная сопротивлению столба раствора (или другой жидкости) длиной в 1 см и площадью сечения в 1 см 2.

Размерность удельной электропроводности [Ом^-1.см^-1]. Разумеется, такая размерность соответствует системе СГС. При необходимости перевода в СИ, следует все умножить на 100.

Именно удельная электропроводность как основная величина используется при различных расчетах. Например, для вычисления толщины мембраны эритроцитов в ЗАДАНИИ-4.

Следовательно, для определения удельной электропроводности какой-либо жидкости необходимо иметь сосуд с расстоянием между электродами точно в 1 см, с площадью каждого электрода точно в 1 квадратный см. При этом должна твердая уверенность, что в прохождении электрического тока участвует только объем жидкости, заключенный между электродами. Естественно, нереально иметь в практикуме сосуды с такими параметрами. Поэтому, для каждого конкретного кондуктометрического сосуда определяют его "постоянную";:

Из закона Ома известно, что

, где L длина проводника, S - площадь сечения проводника, а r - удельное сопротивление проводника. Тогда удельная проводимость Х:

и откуда

или

где G и есть постоянная сосуда. Таким образом, если измерять сопротивление раствора удельная электропроводность которого заранее известна, то легко экспериментально найти постоянную G.

б) Как определить константу сосудика и что с ней потом делать?

Постоянную сосуда G определяют следующим образом: в сосуд для измерения электропроводности (рис.3а) наливают раствор, электропроводность которого известна, и измеряют сопротивление R. В качестве такого раствора обычно берут раствор хлорида калия, удельная электропроводность которого для различных температур приведена в таблице 2. Измерив сопротивление раствора хлорида калия, вычисляют G по формуле:

Далее, зная величину G для конкретного сосуда, проводят измерения сопротивления Ri исследуемой жидкости и вычисляют ее удельную проводимость:

Если измерения идут на переменном токе, то вместо Ri следует брать величину Zi,

 

Таблица 2. Удельная электропроводность водных растворов KCl при различных температурах [1/(Ом.см)]

 

температура, °С	Х [ 1/(Ом.см)]
	0.1 Н	0.02 Н	0.01 Н
	0.01048	0.002243	0.001147
	0.01072	0.002294	0.001173
	0.01095	0.002345	0.001199
	0.01119	0.002397	0.001225
	0.01143	0.002449	0.001251
	0.01167	0.002501	0.001278
	0.01191	0.002553	0.001305
	0.01215	0.002606	0.001332
	0.01239	0.002659	0.001359
	0.01264	0.002712	0.001386
	0.01288	0.002765	0.001417

 

3.1.2.2. Определение гематокрита[3] суспензии.

суспензию эритроцитов удобно характеризовать ГЕМАТОКРИТОМ или ГЕМАТОКРИТНЫМ ИНДЕКСОМ - общим объемом эритроцитов относительно всего объема суспензии.

Пример: гематокрит 0.4 - означает, что в суспензии 40% объема занимают эритроциты.

Определение ГЕМАТОКРИТА. В практикуме БИОФИЗИКА КЛЕТКИ гематокрит определяют с помощью специальной центрифуги МГЦ-8.

Чистый капилляр заполняют исследуемой суспензией и укупоривают с одного конца специальной пастой или пластилином. Помещают в ротор центрифуги, так чтобы укупоренные концы упирались в резиновую прокладку по периферии ротора. Обязательно завинтить крышку ротора! Крышка ротора имеет левую резьбу и " подпружинена" благодаря некоторой выпуклости, поэтому при завинчивании ее необходимо несколько придавить в направлении вдоль оси ротора. Придавливать за головку гайки привинчивания Крышки. Центрифугируют 5 минут при 8000 оборотов (то есть полный взвод ручки включения). По отсчетной шкале, приложенной к центрифуге МГЦ-8, определяют высоту столбика клеток и общую высоту столбика жидкости в капилляре) их отношение и дает гематокритную величину (рис.10).

 

суспензию считать концентрированной - если гематокрит не ниже 0.2.

 

рис.10. Определение гематокрита:

, где: Ht – гематокрит,

Н₁ – высота столба уплотненных

клеток, Н₂ –общая высота столба

жидкости в капилляре.

 

разумеется, гематокрит следует определять только для исходной, достаточно концентрированной суспензии клеток. Для остальных суспензий, получаемых разбавлением исходной, гематокрит определяется только расчетным способом. Например, если исходная суспензия, с гематокритом 0,3 разведена в 1000 раз, то гематокрит в разбавленной суспензии равен 0,0003.

 

3.1.2.3. Расчет удельного сопротивления дисперсной фазы.

Для гетерогенной системы дисперсная фаза которой состоит из однородных клеточных частиц СФЕРИЧЕСКОЙ ФОРМЫ, между удельным сопротивлением всей системы в целом (Z), удельным сопротивлением дисперсионной среды (Z₁), удельным сопротивлением дисперсионной фазы (Z₂) и относительным объемом, занимаемым, в системе дисперсной фазой (р- объемный индекс или гематокрит) существует соотношение, выражаемое формулой Максвелла:

(3)

В случае высокого значения сопротивления клеток (относительно среды) формула (3) упрощается и принимает вид:

(4)

 

 

Пользуясь данными таблиц (их по числу разбавлений клеток + еще одна со средой). Необходимо рассчитать по формуле (3) или (4) удельные сопротивления суспензий эритроцитов для всех вариантов суспензий и всех частот.

В общем случае удельное сопротивление дисперсной фазы не должно зависеть от концентрации клеточных тел в конкретной суспензии. Поэтому построив зависимость удельного сопротивления дисперсной фазы (Z₂) от концентрации клеток, можно найти те области частот и те области концентраций, где действительно электропроводность суспензии подчиняется формуле Максвелла (3). Результаты измерений в найденных областях можно использовать для последующих вычислений.

3.1.2.4. Расчет толщины липидного слоя мембран клеток по удельному импедансу суспензии эритроцитов.

 

Разумеется, расчет тольщины мембраны эритроцитов по электропроводности может быть выполнен лишь с рядом допущений или приближений.

Приближения – 1) предполагаем, что эритроциты СФЕРУЛИРОВАНЫ. Приближение означает, что мы считаем эритроциты всегда правильными сферами.

2) полагаем, что эквивалентная электрическая схема для эритроцита представляет собой параллельное соединение емкости и резистора.

3)полагаем, что для диапазонов частот выбранных в предыдущем разделе (3.1.2.3) емкость мембран не зависит от частоты.

Для случая указанных приближений соотношение мемжду удельным импедансом дисперсной фазы, емкостью и сопротивлением будет описываться соотношениеми:

(5)

(6)

таким образом, для каждой частоты, при каждой концентрации клеток можно написать систему из двух уравнений с двумя неизвестными. Решив их, следует выбрать те, где полученные значения R и С совпадают. Зная гематокрит и концентрацию клеточных тел в суспензии можно определить средний объем одной клетки: , при условии, что размерность С – [клеток/мл] размерность V – также получается в мл или в см³. Зная объем сферы легко найти площадь ее поверхности: ,где r- радиус сферы.

,где S – площадь поверхности сферы. Умножив площадь поверхности одной клетки на концентрацию найдем суммарную площадь в единице объема (S_уд= S´C)

Пользуясь формулой емкости для плоского конденсатора можно расчитать толщину слоя диэлектрика:

величину диэлектрической проницаемости липидов (e) принимаем лежащей в пределах 2 ¸ 4[4].

 

3.2. задание 2. Измерить импеданс эквивалентной схемы на тех же частотах.

В случае если, в качестве основного задания предложено №1, №4, №5, то задание №2 носит скорее тренировочный характер. В этом случае следует включить эквивалентую схему в режиме параллельного соединения R и С, а шунтирующий их резистор отключить. Значения взять средние. После получения экспериментальной зависимости импеданса от частоты целесообразно для двух крайних и среднего значений частоты расчитать R и С решая систему уравнений:

(5)

(6)

 

и сопоставить результаты с номиналами выставленными на устройстве.

 

В случае если, в качестве основного задания предложено №3, то следует подобрать ту схему включения и номиналы, которые воспроизведут (а следовательно смоделируют) дисперсию электропроводности мышцы. Причем необходимо смоделировать как живую, так и фиксированную спиртом мыцу.

 

3.3.задание 3. Измерить импеданс икроножной мыцы лягушки.

Особенностью этого задания является использование другой ячейки (рис.2). мышцу располагают волокнами вдоль оси электродов и измеряют, затем поперек оси электродов и также измеряют.

Затем мышцу 20 минут фиксируют в спирте и повторяют измерения.

Результаты представляют аналогично описанным в разделе 3.1.1.

 

3.4.задание 4. Измерение импеданса суспензии эритроцитов при различных осмотических давлениях раствора.

Задание аналогично полному варианту задания 1 (см. раздел 3.1.2.). Однако здесь не одна исходная суспензия эритроцитов, а две – вторая готовится в гипотоническом растворе (клетки раздуты). Цель – определить как изменилась толщина липидного слоя мембран.

3.5. задание 5. По сути это -- исследование влияния токсического агента на дисперсию электропроводности суспензий клеток.

 

Зависимость импеданса биологических объектов от частоты и называется дисперсией электропроводности. В общем случае, для живых объектов (кусочек ткани, мышцы, суспензия клеток) характерно резко выраженное снижение импеданса при повышении частоты. По мере отмирания объекта (повреждения мембран) разница импеданса для малых и высоких частот уменьшается.

Само же выполнение измерений ничем не отличается от задания 1 (облегченный вариант-раздел 3.1.1.). только объект предварительно подвергнут токсическому воздействию. Контролем служит тот же объект до воздействия.

 

4.приложения.

4.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕЛ В СУСПЕНЗИИ ПРЯМЫМ МЕТОДОМ.

В условиях практикума "биофизика клетки" концентрацию клеток в приготовленных суспензиях проще всего определять путем подсчета в камерах типа камеры Горяева или камеры Фукса-Розенталя.

Возможно еще определение с автоматических счетчиков форменных элементов типа" Целлоскоп" или "Пикаскель". Однако, для автоматических счетчиков необходима специальная насадка с микро-отверстием калиброванного диаметра. Счетчики работают по принципу продавливания суспензии клеток через калиброванное отверстие с заданной скоростью. Подсчет частиц (клеток и т.п.) происходит электрометрическим методом, с автоматической регистрацией. Насадка давно украдена студентами, а самостоятельное изготовление такой насадки весьма затруднительно.

При работе со счетными камерами также есть аналогичные трудности - требуются специальные шлифованные покровные стекла. Академия давно не снабжается такими стеклами, а имевшийся на кафедре значительный запас также украден студентами, небольшое количество лежавшее непосредственно на рабочих местах практикума - раздавлено студентами. Тем не менее, данную трудность можно обойти, если учитывать принцип устройства счетной камеры.

Счетные камеры состоят из толстого предметного стекла с нанесенными поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. По обе стороны средней площадки в камере Горяева расположены две других на 0.1мм (в камере Фукса-Розенталя на 0.2 мм) выше средней. Плоскости этих площадок служат для ПРИТИРАНИЯ ПОКРОВНОГО СТЕКЛА ДО ПОЯВЛЕНИЯ так называемых НЬЮТОНОВЫХ КОЛЕЦ. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (капиллярные пространства, через которые и заполняют камеру.

Следовательно, если обычное покровное стекло достаточно плотно прижать к поверхности боковых площадок, то, в принципе, получим такой же зазор (0.1 или 0.2 мм). Иногда удается и притереть обычное покровное стекло к поверхности площадок до появления Ньютоновых колец, но чаще оно при этом просто давится. Кстати, чтобы притирать шлифованные или любые другие поверхности до такой степени слипания, поверхности должны быть хорошо обезжирены..

Принцип сеток один и тот же. Они разделены на то или иное число квадратов, различным образом сгруппированных.

Постоянной величиной во всех сетках является "малый квадрат", Сетка камеры Горяева (рис.1а) содержит 225 больших квадратов - 15 рядов по 15 больших квадратов в каждом - разграфленных вертикально, горизонтально, крест на крест и неразграфленных.

Большие квадраты сетки Фукса-Розенталя (рис.1a) не разграфлены, сгруппированы по 16 квадратов, каждая группа ограничена тройными линиями.

Подсчет форменных элементов в камерах производят по формуле:

 

где: Х - количество форменных элементов в 1 мкл

А - сумма всех сосчитанных форменных элементов

В - количество сосчитанных малых квадратов

С - разведение исходной суспензии (во сколько раз развели).

V - объем одного малого квадрата.