В качестве первого антитела используем mouse monoclonal Anti-pan Keratin antibody [80] (ab8068) от Abcam.

 

 

Фиксация

Вырезанные пробы кожи фиксируются в 10%-й растворе забуференного нейтрального формалина (pH=7) при комнатной температуре. Продолжительность фиксации 5-12 часов.

Возможно кратковременное (несколько дней) хранение образцов в фиксаторе.

Отмывка от фиксатора производится в проточной воде в течение часа.

 

Заморозка образцов

После отмывки образцы погружаются в небольшую емкость (V = 2-4 объема пробы) содержащую криопротективную среду Tissue-Tek и замораживается путем полного погружения в жидкий азот.
Транспортировка образцов осуществляется в замороженном состоянии (сосуд Дюара, неплотно закрытый стальной термос и т.д.)
Замороженные образцы могут храниться длительное время в низкотемпературном морозильнике при температурах порядка -80 градусов Цельсия.

Получение срезов
Резка материала производится на криомикротоме, при температуре -25 градусов
(http://core.phmtox.msu.edu/Scheduling/ItemDocs/16/HM550_Brochure.pdf, -25 это температура для резки кожи)

Образцы извлекают из азота/морозильника и помещают в камеру криомикротома на 30-60 минут для выравнивания их температуры с температурой камеры.

На охлажденный держатель наносится небольшое количество криопротектора Tissue-Tek и немедленно на него монтируется проба ткани. Ориентировка образца осуществляется таким образом, чтобы получить продольный срез всех слоев эпидермиса.

Для резки используются специальные сменные микротомные лезвия (угол заточки 35гр).
Рекомендуемая толщина среза - 5-7 мкм.
Полученные срезы переносятся легким касанием на теплые полилизиновые стекла Menzel, срезы раскладываются "книжкой" по 4 на стекло.
На стекло графитовым карандашем или устойчивым к растворителям лабораторным маркером наносится информация о номере пробы и порядковом номере стекла в ней.
Стекла со срезами могут длительное время храниться в низкотемпературном морозильнике.

 

Иммуногистохимия

 

С целью повышения наглядности и ускорения анализа препаратов создаем набор для одновременного выявления двух антигенов.

Для повышения чувствительности иммуногистохимической реакции и учитывая вероятную необходимость обеспечить хранение полученных препаратов в течение длительного времени отдаем предпочтение системам из двух антител и используем для визуализации гистохимические реакции.

 

Выбор антител для выявления кератина 67кД

В качестве первого антитела используем mouse monoclonal Anti-pan Keratin antibody [80] (ab8068) от Abcam.

http://www.abcam.com/pan-keratin-antibody-80-ab8068.html

 

Второе антитело соответственно Goat polyclonal Secondary Antibody to Mouse IgG1 - heavy chain (HRP)

http://www.abcam.com/Goat-Mouse-IgG1-heavy-chain-HRP-ab97240.html

Выбор животного донора обусловлен относительно высоким различием в структуре иммуноглобулинов между козлом и мышью.

IHC-P		1/200 - 1/2000.

 

 

Abcam Anti-Ki67 antibody [PP-67]

 

- заключение препарата (среда заключения, особенности проводки (если нужна) и хранения готовых образцов)

Препараты после проведения иммуногистохимических реакций проводятся по восходящим концентрациям спиртов в рамках стандартной гистологической процедуры. Изготовление постоянных препаратов производится с использованием среды заключения Biomount.

Препараты после осуществления микроскопического анализа переносят в архив (комнатная температуры, темнота), где они сохраняются до закрытия медицинской карты пациента (или прописать срок)?.

 

- микроскопическое исследование (что и как смотреть и считать, какие требования по анализу препарата, есть ли специфические требования по оборудованию?)

С помощью светового микроскопа производится анализ контролей (без первых АТ). Контрольные препараты, не должны иметь окрашивания вызванного неспецифическим связыванием либо вторых АТ с тканью либо компонентов визуализации с тканью. Возможно придется дополнительно дорабатывать методику для обеспечения полного подавления ферментативной активности (эндогенная пероксидаза и щелочная фосфатаза).

Анализ препарата:
С использованием объектива х40 производится анализ препарата и съемка (в кадре должен попадать базальный слой и возможно большая площадь следующих слоев эпидермиса) последовательно перемещаясь вдоль базального слоя. При указанном увеличении с каждого анализируемого среза делается 50 фотоснимков (фокус при съемке на специфическом окрашивании).

С помощью программы ImageJ осуществляется подсчет числа позитивно окрашенных клеток, а также общего числа клеток базального и шиповатого слоев. На основании полученных данных в Microsoft Exel строятся гистограммы, включающие указанную стандартную ошибку.
Полученные данные могут сравниваться с имеющимися ранее с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, входящего в програмный пакет Statistiсa.