Студопедия — Схема исследования стафилококков
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Схема исследования стафилококков






I день

 

       
 
   
 

 


6,5 % солевой бульон ЖСА, МЖСА, МСА, КА

(среда накопления)

 

ТС 37°С 48 час или

37° С 20 час и затем при температуре 20° С на 18-20 час

 

II день

Высев со среды накопления на плотную среду.

 
 

ЖСА Далее по схеме

 
 


6,5 % СБ

 

 

III день

1. Морфология колоний, определение пигмента.

2. Определение лецитовителлазной активности (ЛВА), т.е. наличие фермента – лецитовителлазы (мутный венчик вокруг колонии)

3. Мазок, окраска по Граму.

4. Определение каталазы.

5. Пересев на скошенный питательный агар для накопления чистой культуры (минимум пересевают 2 колонии).

ТС 37° С 18-20 ч.

морфология

колоний

       
   


пигмент ЖСА

ЛВА

 
МПА

Н2О2

мазок и окраска

по Граму


IV день

1. Просматривают рост культуры на скошенном МПА.

2. Мазок, окраска по Граму.

3. Определение ХОФ.

4. Постановка РКП.

5. Определение АМФ.

6. Определение ДНКазы.

7. Определение фосфотазы.

8. Определение чувствительности к антибиотикам (если грамположительные кокки, ЛВА+, ХОФ+ или через три часа РКП+).

ТС 37° С 18–20 ч.

V день

1. Учет биохимических тестов (определение вида микроорганизма).

2. Учет чувствительности к антибиотикам (если на 4-й день чувствительность к антибиотикам не была поставлена, то ее ставят на 5-й день и учитывают на 6-й).

3. Если выделен Staphylococсus aureus, то проводится его фаготипирование.

4. Выдача результатов.

5. При необходимости провести дополнительные исследования.

 

VI день

1. Учет дополнительных тестов:

- учет фаготипирования;

- -учет чувствительности к антибиотикам, поставленный на 5-й день

2. Выдача результатов

 

Бактериологический метод

1 этап:

Посев исследуемого материала на элективные среды (желточно-солевой, молочно-солевой или молочно-желточно-солевой агар) и среду накопления (6,5% солевой бульон). Посев производят тампоном, которым забирали материал. Тампон следует многократно поворачивать, чтобы перенести на питательную среду максимальное количество взятого материала. При посеве смыва из зева на питательную среду наносят 0,1 мл жидкости и растирают на поверхности среды шпателем. Засеянные среды выдерживают в термостате при 37 ºС в


течение 2 суток, либо одни сутки в термостате и дополнительно 24 ч на свету пи комнатной температуре.

2 этап:

1. Просмотр чашек, фиксация в журнале характера и массивности роста. На элективных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. На средах, содержащих желток, Staphylococcus аureus выделенный от человека, в 60–70% случаев образует радужный венчик вокруг колонии (положительная лецитоветилазная реакция).

2. Делают мазок из подозрительных колоний и окрашивают по Граму. В мазке видны грамположительные кокки, располагающиеся попарно или чаще всего в виде гроздьев винограда.

3. Определение каталазы: на предметное стекло наносят каплю 3% перекиси водорода и растирают в ней выделенную культуру. В случае положительной реакции образуются пузыри, исчезающие в течение минуты.

4. Пересев на скошенный МПА для накопления чистой культуры. Минимум пересевают две колонии. Инкубируем в термостате при температуре 37 ºС, 18–20 ч.

3 этап:

1. После суточной инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию: St. аureus дают обильный, равномерный, сочный рост; St.epidermidis – очень скудный, неравномерный рост по ходу посева.

2. Делают мазок и окрашивают по Граму. По микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кусками («кружево»).

3. Определение хлопьеобразующего фактора. Для этой реакции используют плазму кролика. В пробирку приливают 0,5 мл кроличьей плазмы, разведенной 1:5, а затем в нее вносят 18–20 часовую агаровую культуру стафилококков.

Размешивают и смотрят образование хлопьев; или на предметное стекло наносят каплю разведенной плазмы и растирают в ней исследуемую сыворотку, смотрят образование хлопьев в течение 1 мин.

4. Постановка реакции коагуляции плазмы (РКП). С помощью этой реакции проверяют плазмокоагулирующую активность.


Для реакции может быть использована свежеприготовленная или сухая цитратная плазма крови кролика в разведении 1:5 в количестве 5 мл (к 1 мл плазмы добавляют 4 мл стерильного физиологического раствора).

Разведенную плазму разливают в стерильные пробирки (без пробок) по 0,5 и в каждую вносят по одной петле 18–20 часовой агаровой культуры стафилококка (или к 0,5 мл плазмы добавляют 0,5 мл 18 часовой бульонной культуры стафилококка).

Контроль реакции ставится в заведомо коагулазоположительной и коагулазоотрицательной культурах. Пробирки помещают в термостат при 37º С и проверяют наличие свертывания плазмы через 3 ч, затем пробирки вынимают, оставляют при комнатной температуре на 18–20 ч. Окончательный учет реакции проводится на следующий день

Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы – от небольшого сгустка, взвешенного в плазме, до полного неподвижного сгустка. Реакция в контроле должна быть выражена четко: наличие сгустка с культурой золотистого стафилококка и отсутствие его в другой пробирке.

Если культура обладает плазмокоагулирующей и лецитоветилазной активностью, выдается ответ о выделении St. аureus, проведения дополнительных исследований не требуется.

Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитоветилазной активностью, то для окончательного ответа требуется определение других признаков патогенности (ферментация маннита в анаэробных условиях – АФМ и ДНКазной активности).

Если же РКП и лецитоветилазная активность дают отрицательный результат, значит, исследуемый возбудитель является St.epidermidis.

5. Определение ферментации маннита в анаэробных условиях и аэробных условиях.

В анаэробных условиях для реакции можно использовать среду, приготовленную из сухого агара с индикатором ВР, содержащую манит. Среду разливают в пробирки по 4,0 мл и стерилизуют. По мере надобности пробирки со средой регенерируют и добавляют по 2,0 мл стерильного вазелинового масла. Когда среда остынет, уколом (со дна) производят посев исследуемой культуры.. Пробирки помещают в термостат при 37º С на 5 суток. В случаях разложения маннита среда приобретает синий цвет по всему столбику агара.

В аэробных условиях на чашки Петри со средой, содержащей манит, производят посев бляшками, не более 6 культур на 1 чашку, т.е. условно делят чашку на шесть секторов. Также ставят в термостат при 37º С на 18–20 ч. При положительном результате реакции наблюдается пожелтение среды вокруг бляшки, если же окрашена сама бляшка, то результат реакции отрицательный.

6. Определение ДНКазной активности. Используют 2% агар на переваре Хоттингера или приготовленный из сухого питательного агара (рН 8,6). По мере надобности агар расплавляют и в него добавляют ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) из расчета 2 мг на 1 мл среды. На чашку со средой засевают полоской от 10 до 20 культур стафилококка. Чашки помещают в термостат при 37º С на 18–20 ч, после чего их заливают 5,0–7,0 мл раствора соляной кислоты. Учет реакции проводится после 7–10 минутного контакта кислоты со средой, которая перед учетом реакции сливается.

При оценке реакции на ДНКазу возможны следующие варианты:

а) наличие четкой зоны просветления среды - положительная реакция;

б) полное отсутствие зоны просветления – отрицательная реакция;

в) наличие нечеткой, небольшой зоны просветления среды – сомнительная реакция. В данном случае реакцию необходимо повторить.

7. Определение фосфатазной активности.

а) В 100 мл растительного и охлажденного до 10º С питательного агара добавляют 50 мг паранитрофенилфосфата. Смесь разливается стерильно в чашки (по 10–12 мл на чашку). Чашки с застывшим агаром подсушивают и на каждую из них точечным посевом наносятся исследуемые культуры (16–20 культур). Чашки помещают в термостат при 37º С на 24 ч. Появление интенсивного желтого окрашивания вокруг посевов регистрируется как положительная реакция.

б) Вместо паранитрофенилфосфата можно использовать фенолфталеинфосфат 0,05%. Также производят точечный посев исследуемой культуры. Инкубируют при 37º С, 24 ч. Затем культуру обрабатывают парами аммиака.


Чашку переворачивают дном кверху, наливают несколько капель нашатырного спирта, затем чашку закрывают на несколько минут. При положительной реакции колонии окрашиваются в малиновый цвет.

в) Реакция Фонса–Проскауэра (в модификации Барита).

Исследуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка. После трех дней роста при 37º С, 1,0 мл культуры переносят в пробирку и прибавляют 0,6 мл альфа-нафтола (5% раствор в абсолютном спирте) и 0,2 мл КОН (40% раствор) и взбалтывают. В положительном случае через 2–5 минут наступает розовое окрашивание. В отрицательных случаях розового окрашивания не наступает и раствор принимает цвет меди (КОН + α-нафтол).

Если в мазке были обнаружены кокки сине-фиолетового цвета, расположенные в виде гроздьев винограда, а также ЛВА положительная, имеется хлопьеобразующий фактор или через три часа положительная РКП, то определяют чувствительность микроорганизма к антибиотикам.

8. Определение чувствительности стафилококка к антибиотикам. Степень чувствительности выделенных культур возбудителей к антимикробным препаратам необходимо знать для рационального подбора средств эффективной антимикробной терапии и профилактики возникновения и распространения инфекций. Другой стороной этих исследований является получение данных резистограмм, которые могут служить удобным инструментом-маркером в эпидемиологических исследованиях.

 

Метод серийных разведений

Серийные разведения в плотных средах (агар Мюллера-Хинтона) чаще используют для одновременного тестирования большого количества микробных штаммов (для посева можно использовать специальный штамп-репликатор). Учетным признаком в этом случае является наличие или отсутствие роста на поверхности агара.

Метод серийных разведений считается наиболее точным, но относительно трудоемким и дорогим.

 


Диско-диффузионный метод

При определении чувствительности методом диффузии в агар чистую культуру возбудителя засевают «газоном» на питательный агар в чашке, например, тампоном, смоченном в стандартизованной (108 КОЕ/мл) суспензии микроорганизма. Затем на поверхность агара укладывают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, которые диффундируют в агар, создавая градиент концентрации. На чашку диаметром 90 мм равномерно укладывают 6-8 дисков.

После инкубирования в термостате измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности к тому или иному антибиотику (рис. 1).

 

Рис. 1. Определение

антибиотикочувствительности

диско-диффузионным методом

 

 

Исходя из значения МИК (минимальная концентрация), можно определить терапевтический индекс: Т=МИК/К.

Следовательно, по диаметру зоны можно определить степень чувствительности к тому или иному антибиотику: чувствительные (S), умеренно-устойчивые (I) и устойчивые (R).

К категории S (от англ. sensitive, чувствительный) относят те, для которых использование средних терапевтических доз будет достаточным для трехкратного превышения МИК.

В категорию I (от англ. intermediate, промежуточный) относят те микробы, для подавления которых потребуются максимальные терапевтические дозы.

Категорию R (от англ. resistant, устойчивый) составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным in vivo.


Другие методы

Промежуточное положение между двумя вышеописанными методами занимает метод определения чувствительности с помощью Е-тестов (Е-test). Последние представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16, 8, 4,... мкг/мл). Е-тесты, как и диски при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде «газона». После инкубирования вокруг полоски формируется эллипсовидная зона задержки роста, которая, сужается в области малых концентраций и «пересекает» полоску на уровне, соответствующем величине МИК.

При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам.

Наиболее часто применяют метод серийных разведений в планшетах и метод пограничных концентраций (микрометоды). В первом случае, как правило, используют готовые стерильные 96-луночные планшеты, в лунки которых внесены лиофильно высушенные в бульоне убывающие концентрации антибиотиков. После вскрытия планшета стандартизованную суспензию испытуемой культуры в одинаковой дозе (например, 0,1 мл) асептически вносят в соответствующие ряды лунок, закрывают крышкой и инкубируют при оптимальной температуре. После инкубирования отмечают рост (помутнение бульона) в тех лунках планшета, где антибиотик не действует.

При наличии помутнения бульона в контроле культуры и опытных лунках определяют величину МИК.

Метод пограничных концентрацийможно считать усеченным методом серийных разведений. В соответствии с ним испытуемую культуру вносят только в две лунки (пробирки), где находятся высокая (С) и низкая (с) концентрации антибиотика. Концентрация «С» соответствует границе между устойчивыми и умеренно-устойчивыми штаммами, а концентрация «с»- границе между умеренно-устойчивыми и чувствительными штаммами.

Если после инкубирования рост отсутствует в обеих лунках, штамм относят к чувствительным, если только в лунке с концентрацией «С»-к умеренно-устойчивыми штаммам, а если в обеих лунках имеется рост, штамм относят к устойчивым. Результат этого исследования имеет качественное (полуколичественное) выражение, но само исследование отличается простотой и экономичностью.

Многие модификации метода серийных разведений сводятся к способу учета результата: колориметрическое, турбидиметрическое, флюорометрическое исследование и др.

Также чувствительность к антибиотикам можно определить в течение восьми часов с помощью бактериологического анализатора Феникс-1000.

 

4 этап:

1. Учитываем биохимические тесты (табл. 2).

Таблица 2

Концентрация антибиотика в крови (К, мг/кг)

после введения средне терапевтических доз препарата

Антибиотик К Антибиотик К
Ампициллин 15–25 Полимиксин В 10–15
Бензилпенициллин 0,52 (ЕД/мл) Рифампицин 15–20
Ванкомицин 10–15 Срептомицин 20–25
Гентамицин 6–8 Тетрациклин 3-5
Канамицин 15–20 Тобрамицин 6–8
Линкомицин 10–15 Фузидиевая кислота 10–20
Метициллин 10–15 Хлорамфеникол 5–10
Оксациллин 4–6 Цефалексин 15–25
Олеандомицин 3-5 Эритромицин 3-5

 


2. Учитываем чувствительность к антибиотикам.

Измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности к тому или иному антибиотику.

3.Если же выделен Staphylococcus аureus, то проводится его фаготипирование. Определение фаговара культуры имеет важное эпидемиологическое значение для выявления источника инфекции и путей заражения. Основной международный набор стафилококковых фагов состоит из 21 типа, разделенных на 4 группы. Наибольшее значение при внутрибольничных стафилококковых инфекциях имеют представители фаговаров 77 и 80. Вместе с тем довольно часто (до 40% случаев) встречаются нетипируемые штаммы стафилококков.

 

Серологический метод обнаружения стафилококков

Для подтверждения стафилококковой инфекции серодиагностика имеет вспомогательное значение. Определение стафилококкового антитоксина в сыворотке крови при диагностике хронических стафилококковых инфекций имеет большое значение, так как бактериологические исследования, проведенные на фоне массивной антибиотикотерапии, как правило, остаются безрезультатными. Можно использовать РНГА (реакция непрямой гемагглютинации) с эритроцитарным стафилококковым диагностикумом (эритроциты нагружены a–токсином стафилококка).

Сущность этой реакции заключается в том, что эритроциты, обладая способностью адсорбировать на себе антигены, становятся сенсибилизированными к соответствующей иммунной сыворотке. Под действием специфических антител сенсибилизированные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне лунки или пробирки гемагглютинат в виде «зонтика».

Реакция отличается высокой чувствительностью и позволяет выявлять сравнительно небольшие концентрации антител в исследуемой сыворотке.

В основе другой реакции лежит метод подавления гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксином сыворотки больного.


Для этого к определенной дозе стафилококкового токсина прибавляют сыворотку больного, разведенную 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 и т.д., тщательно перемешивают и к смеси добавляют 0,5 мл эритроцитов кролика. Результаты реакции учитывают после инкубирования пробирок в течение 1 ч при температуре 37º С и такого же периода при комнатной температуре.

Количество сыворотки, в смеси с которым гемолиз слабый или не обнаруживается, считают титром.

 

Экспресс-диагностика стафилококков

Одним из современных методов определения стафилококков является Микро-Ла-тест.

Наборы Микро-Ла-тест – это микротитровальные атипированные 96-луночные пластинки с 1, 2 или 3-рядными вертикальными стрипами дляпостановки 8, 16 и 24 биохимических реакций. Луки стрипов содержат микролизированные субстраты.

 

При добавлении суспензий микроорганизмов субстраты растворяются, в ходе инкубации происходят химические реакции, результаты которых можно зарегистрировать по изменению цвета индикатора или после добавления реактива либо визуально, либо автоматически при наличии фотометра.


Преимущества:

- высоко стандартизированный процесс идентификации;

- набор типов позволяет проводить более точную дифференциацию таксонов;

- сокращает сроки исследования и трудозатраты;

- надежность идентификации;

- экономичность.

СТАФИтест 16 предназначен для рутинной идентификации стафилококков, особенно коагулазо-отрицательных штаммов, изолированных из клинического материала и пищевых продуктов.

Набор содержит 16 биохимических тестов, помещенных в 2-рядный вертикальный стрип микротитровальной пластинки.

Для идентификации дополнительно используют диагностические полоски Микро-ЛА-Тест: ВПтест- определение продукции ацетоина, при необходимости ОКСИтест и диагностические диски НОВОБИОЦИН. Один набор СТАФИтест 16 содержит 10 пластинок, что позволяет провести идентификацию 60 культур.

 

Кат. номер Наименование Количество определений Срок хранения, мес
  СТАФИтест 16    
  ВПтест    
  ОКСИтест    
  Реактив для теста ОКСИДАЗА    
  Реактив для теста АЦЕТОИН    
  Реактив для теста ФОСФАТАЗА    
  Реактив для теста НИТРАТЫ    
  Парафиновое масло, стерильное 54 мл/180  

 

 








Дата добавления: 2015-10-19; просмотров: 3633. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Кардиналистский и ординалистский подходы Кардиналистский (количественный подход) к анализу полезности основан на представлении о возможности измерения различных благ в условных единицах полезности...

Обзор компонентов Multisim Компоненты – это основа любой схемы, это все элементы, из которых она состоит. Multisim оперирует с двумя категориями...

Композиция из абстрактных геометрических фигур Данная композиция состоит из линий, штриховки, абстрактных геометрических форм...

Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...

Принципы и методы управления в таможенных органах Под принципами управления понимаются идеи, правила, основные положения и нормы поведения, которыми руководствуются общие, частные и организационно-технологические принципы...

ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ САМОВОСПИТАНИЕ И САМООБРАЗОВАНИЕ ПЕДАГОГА Воспитывать сегодня подрастающее поколение на со­временном уровне требований общества нельзя без по­стоянного обновления и обогащения своего профессио­нального педагогического потенциала...

Эффективность управления. Общие понятия о сущности и критериях эффективности. Эффективность управления – это экономическая категория, отражающая вклад управленческой деятельности в конечный результат работы организации...

Вопрос 1. Коллективные средства защиты: вентиляция, освещение, защита от шума и вибрации Коллективные средства защиты: вентиляция, освещение, защита от шума и вибрации К коллективным средствам защиты относятся: вентиляция, отопление, освещение, защита от шума и вибрации...

Задержки и неисправности пистолета Макарова 1.Что может произойти при стрельбе из пистолета, если загрязнятся пазы на рамке...

Вопрос. Отличие деятельности человека от поведения животных главные отличия деятельности человека от активности животных сводятся к следующему: 1...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.011 сек.) русская версия | украинская версия