Види патентного пошуку. ………………………………………………….. 3

Мета роботи. Ознайомити студентів із використанням РЗК у ветеринарній практиці, освоїти техніку її постановки.

Обладнання і устаткування. Фізіологічний розчин; 2,5 % суспензія еритроцитів барана у фізіологічному розчині, бруцельозний антиген, позитивна бруцельозна сироватка, нормальна сироватка великої рога­тої худоби, комплемент морської свинки, гемолізин, мірні піпетки на 1-2 мл, водяна баня.

Реакцію зв'язування комплементу (РЗК) вперше описали Борде і Жангу у 1901 р. В основі реакції лежать два явища - бактеріоліз та гемоліз. У прояві цих явищ бере участь комплемент.

Реакція утворення комплексу антиген - антитіло - комплемент невидима. Щоб виявити взаємодію компонентів, використовують до­даткову індикаторну систему, яка відображає результат взаємодії у пер­шій системі. Таким чином, РЗК передбачає використання двох систем: бактеріолітичної та гемолітичної.

РЗК здійснюють у два етапи. Спочатку готують бактеріолітичну систему. У пробірках змішують по 0,5 мл досліджуваної інактивованої сироватки з антигеном, додають комплемент у чітко визначеній кіль­кості.

Суміш антиген - антитіло (сироватка) - комплемент (бактеріолі-тична система) поміщають на водяну баню (термостат) при температурі 37-38 °С на 20^40 хвилин. Результат взаємодії компонентів у пробірці невидимий, рідина залишається прозорою і безбарвною. Щоб визначи­ти, зв'язався комплемент у бактеріолітичній системі чи ні, необхідний другий етап реакції. Для цього у пробірки вносять компоненти гемолі­тичної системи (відмиті еритроцити барана та інактивовану гемолітичну сироватку) й знову ставлять на водяну баню на 15-20 хвилин.

Враховують попередній результат — наявність чи відсутність гемо­лізу, залишають пробірки при кімнатній температурі на 18-20 годин і враховують остаточний результат.

Якщо сироватку одержано з крові хворої тварини, то в ній є антитіла, які з'єднуються з відповідним антигеном. З комплексом антиген - ан­титіло зв'язується комплемент. Відсутність останнього не призведе до гемолізу еритроцитів в індикаторній системі, що свідчить про позитив­ний результат постановки реакції.

Якщо сироватку одержано з крові здорової тварини, то вона антитіл не містить, комплекс антитіло - антиген не утворюється, комплемент у бактеріологічній системі не зв'язується. При внесенні у пробірку еритроцитів та гемолізину відбудеться гемоліз. Результат постановки реакції в такому випадку вважають негативним.

РЗК використовують для визначення наявності у сироватці кро­ві хворої тварини специфічних антитіл (при діагностиці бруцельозу, перипнсвмонії, сапу, лептоспірозу та ін.), вияву у досліджуваному ма­теріалі специфічного антигену (бактеріальний, вірусний) при наявності специфічної імунної сироватки.

Для постановки РЗК потрібно такі компоненти: проби сироваток з крові тварин, направлених на дослідження, дві позитивні проби си­роваток крові (стандартні, гіперімунні, які забезпечують позитивний результат - для контролю) та дві проби сироваток з крові здорових тварин - також для контролю (усі сироватки в розведенні 1:10 інакти-вують з метою руйнування їх власного комплементу прогріванням на водяній бані при температурі 56-58 °С протягом ЗО хвилин); антиген у розведенні відповідно до титру (зазначеного на упаковці); комплемент-сироватка крові морської свинки (у розведенні відповідно до встановле­ного титру); гемолізин у робочому титрі; суспензія еритроцитів барана у розведенні 1: 40; фізіологічний розчин.

Сироватки, що надійшли для дослідження, та контрольні (пози­тивні, нормальні) розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1: 5 або 1: 10, інактивують на водяній бані при температурі 56-58 °С протягом 30 хв. (сироватки крові ослів, мулів, лошаків інактивують при температурі 61 °С протягом 30 хвилин).

Антиген для РЗК готують на біофабриках. Як правило, це екстра­кти із зруйнованих бактерій або інфікованих ними тканин. Антигени не повинні викликати гемолізу еритроцитів, що контролюється під час постановки реакції (у пробірку вносять 1-2 робочі дози антигену й 0,5 мл суспензії еритроцитів). На упаковці антигену зазначено номер серії, контроль, дату виготовлення, строк придатності, активність, тобто у якому розведенні його слід використовувати при постановці реакції - 1: 100, 1: 150 і т. д. При тривалому зберіганні робочий титр антигену встановлюють у лабораторії шляхом титрування.

Гемолізин готують на біофабриках гіперімунізацією кролів відми­тими еритроцитами крові барана. Кролям внутрішньовенно 5-6 разів із 2-3 добовими інтервалами вводять 40-50 % суспензію відмитих ери­троцитів. Через тиждень після останньої ін'єкції у тварин беруть кров. Після утворення та ретракції згустка асептично відсмоктують сироват­ку, інактивують її, консервують гліцерином (1:1) або 0,5 % фенолом, титрують, розливають в ампули. У лабораторії перед постановкою РЗК гемолізин титрують знову.

Схема титрування гемолізину. Останній розводять у співвідно­шенні 1: 100 (0,2 мл гемолізину, консервованого гліцерином +9,8 мл фізрозчину). Крім того, потрібні: комплемент - 1: 20, суспензія еритро­цитів крові барана - 1: 40, фізіологічний розчин N301.

У штативі розміщують два ряди пробірок - один для приготуван­ня розведень гемолізину, другий - для титрування. У першу пробірку вносять вихідне розведення гемолізину - 1: 100, потім здійснюють послідовні розведення (рис. 36).

З кожної пробірки відповідного розведення гемолізину в окрему пробірку переносять по 0,5 мл. В усі пробірки другого ряду вносять по 0,5 мл комплементу та суспензії еритроцитів і по 1 мл фізрозчину, щоб загальний об'єм рідини досягав 2,5 мл. Усі пробірки легенько струшують і ставлять на водяну баню при температурі 37-38 °С на 10-15 хвилин. Результати титрування починають враховувати у пробірках з най­більшою кількістю гемолізину (1: 500, 1: 1000). У пробірці з наймен­шою кількістю гемолізину, де відбудеться повний гемоліз еритроцитів, буде його граничний (фактичний) титр. В даному випадку фактичний титр гемолізину становить 1: 2000.

Для наступної роботи (титрування комплементу, головний дослід РЗК) гемолізин використовують у подвоєному титрі (робочий титр). У наведеному прикладі фактичний титр гемолізину становить 1: 2000, робочий - 1: 1000, тобто при постановці РЗК відтитрований гемолізин потрібно розвести фізіологічним розчином у співвідношенні 1: 1000 (1 мл гемолізину й 1000 мл фізіологічного розчину).

Комплемент відкрито Бухнером (1889). Він має білкову природу. Інактивується при нагріванні до 56 °С протягом 30 хв. під дією ультрафі­олетових променів, хімічних речовин (кислоти, луги, ацетон, хлороформ тощо), струшуванні.

Біологічна промисловість випускає комплемент, консервований ви­сушуванням. Одержують його з крові морських свинок. Ліофілізовавий комплемент зберігається два роки. Перед кожною постановкою РЗК комплемент титрують, тобто визначають його робочу дозу - найменшу кількість, яка зумовлюює повний гемоліз еритроцитів крові барана в стандартних умовах постановки РЗК.

Комплемент титрують у гемолітичній та бактеріолітичній системах.

Для титрування комплементу у гемолітичній системі готують компоненти: комплемент у розведенні 1: 20 (1 мл комплементу+18 мл фізіологічного розчину), гемолізин, розведений відповідно до робочого титру, суспензію відмитих еритроцитів крові барана (1: 40), фізіоло­гічний розчин. У пробірки, поставлені в один ряд у штатив, градуйо­ваною піпеткою розливають різну кількість комплементу, збільшуючи дозу на 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; від 0,22 до 0,43). Потім у ці самі про­бірки вносять фізіологічний розчин у кількості, що становить разом з комплементом 0,5 мл, тобто у першу - 0,37, у наступні - 0,34; 0,31; 0,28 і т. д. Після цього в усі пробірки вносять по 0,5 мл гемолізину та еритроцитів крові барана і по 0,1 мл фізіологічного розчину. Пробірки струшують і ставлять на водяну баню на 10-15 хв. при температурі 37-38 °С. Враховують результат (рис. 37).

При титруванні комплементу та гемолі­зину (всю роботу - від титрування комплементу до постановки основного досліду РЗК - здійсню­ють протягом одного дня) ставлять контроль, кожний компонент у окремій пробірці - 0,5 мл гемолізину у робочому титрі+0,5 мл суспензії еритроцитів+1,5 мл фізіологічного розчину; 0,5 мл комплементу 1: 20 + 0,5 мл еритроцитів +1,5 мл фізіологічного розчину. Пробірки струшують і ставлять на водяну баню. У контрольних пробірках гемолізу не повинно бути.

Схема титрування комплементу у бактеріолітичній системі. Готують комплемент (1: 20), суспензію еритроцитів крові барана (1: 40), гемолізин у робочому титрі й дві позитивні та дві нормальні проби сироватки, специфічний антиген (у титрі, зазначеному на етикетці). Сироватку (1: 10) інактивують при температурі 56-58 °С протягом ЗО хв. Кожну пробу сироватки розливають у два ряди пробірок по 0,5 мл і вносять комплемент у зростаючій кількості, починаючи з дози його титру в гемолітичній системі. У наступні пробірки вносять комплемент, щоразу збільшуючи його дозу на 0,03 мл (як і при титруванні компле­менту у гемосистемі). Додаючи фізрозчин, вирівнюють об'єм вмісту пробірок (до 0,5 мл). У пробірки одного ряду кожної проби сироватки (позитивні й нормальні) додають по 0,5 мл антигену, другого ряду - по 0,5 мл фізрозчину. Всі пробірки струшують і ставлять на водяну баню при 37-38 °С на 30-40 хвилин, після чого в кожну з них вносять по 0,5 мл гемолізину і суспензії еритроцитів, струшують і повторно ставлять на водяну баню на 10-15 хв. Враховують результат титрування, починаючи з пробірок другого ряду кожної проби сироватки (без антигену) і проб нормальної сироватки з антигеном (перший ряд). У цих пробірках слід чекати повного гемолізу, враховуючи лише найменшу кількість комп­лементу, що зумовив цей гемоліз за умови, що у перших рядах пробірок з позитивними сироватками й антигеном з такою ж дозою комплементу буде повна затримка (відсутність) гемолізу. Найменшу кількість комп­лементу, що забезпечує повний гемоліз в нормальній сироватці з анти­геном і без нього, при повній затримці його в позитивній сироватці з антигеном, називають титром комплементу у бактеріолітичній системі. У цьому титрі використовують комплемент при постановці РЗК з діа­гностичною метою.

Постановка головного досліду РЗК (діагностичне дослідження). У штативи ставлять два ряди пробірок (згідно з кількістю проб сироваток досліджуваної крові). Кожну пробу інактивованої сироватки (1: 10) вносять в обидві пробірки по 0,5 мл. У першу пробірку додають специ­фічний антиген (0,5 мл), у другу - фізрозчин без антигену (0,5 мл). Потім в усі пробірки (першого й другого рядів) вносять комплемент (по 0,5 мл), легенько струшують і ставлять на водяну баню на 20-40 хв. при темпера­турі 37-38 °С. Це-бактерюлітична система. Після витримування на водяній бані в усі пробірки вносять ком­поненти гемолітичної системи - гемолізин та суспензію еритроцитів крові барана (по 0,5 мл кожного), струшують, повторно ставлять на водяну баню на 15— 20 хв. Для будь-якої кількості проб дослі­джуваних сироваток як контроль використо­вують позитивну (дає позитивний результат) і нормальну (дає не­гативний результат) сироватки (рис. 38).

Результат враховують двічі: вперше - відразу після виймання з водяної бані, вдруге - через 18-20 годин відстоювання у пробірках при кімнатній температурі. Під час попереднього аналізу звертають увагу на пробірки другого ряду й пробірки з нормальною сироваткою та анти­геном, де має відбутися гемоліз. У пробірках з позитивною сироваткою і антигеном спостерігають відсутність гемолізу (еритроцити зумовлюють рівномірне помутніння вмісту пробірки). Заключний аналіз свідчить про те, що у пробірках, де раніш відмічався повний гемоліз еритроцитів, ніяких змін не відбулось, а у пробірках, де гемоліз не спостерігався, ери­троцити мають вигляд осаду. Рідина над осадом прозора й безбарвна.

Показники реакції вважають достовірними, якщо у пробірках з позитивною сироваткою та антигеном гемоліз відсутній при повному гемолізі еритроцитів у пробірках з позитивною сироваткою без антигену і в усіх пробірках з нормальною сироваткою.

РЗК передбачає контроль антигену, комплементу, гемолізину, ери­троцитів. Для цього в окремі пробірки вносять антиген з еритроцитами крові барана, комплемент з еритроцитами крові барана, комплемент без гемолізину, гемолізин з еритроцитами без комплементу, еритроцити й фізіологічний розчин. Об'єм вмісту кожної пробірки доводять фізіоло­гічним розчином до 2,5 мл. Пробірки струшують, ставлять на водяну баню при температурі 37 °С на 20 хв. В усіх контрольних пробірках гемолізу не повинно бути.

Результат РЗК виражають за допомогою умовних позначень залеж­но від ступеня його інтенсивності: (++++) - повна затримка гемолізу (результат позитивний); (+++) — чітко виражена затримка гемолізу, є значний осад еритроцитів, рідина над ним слабко-рожевого кольору (результат позитивний), (++) - часткова затримка гемолізу, спостері­гається компактний осад еритроцитів, рідина має яскраве червоне за­барвлення (результат сумнівний); (+) - слабка затримка гемолізу, осад незначний, рідина інтенсивно забарвлена у червоний колір (результат негативний); (-) - повний гемоліз ("лакова кров"), осад відсутній (ре­зультат негативний).

РЗК використовують з метою вияву у сироватці крові хворої тва­рини специфічних антитіл (діагностика бруцельозу, сапу, лептоспірозу тощо) та специфічного антигену (бактеріальний або вірусний) у різних матеріалах за допомогою специфічних імуносироваток.

Реакцію тривалого зв'язування комплементу (РТЗК) запропоновано Якобшином (1910). Суть її полягає у тому, що бактеріолітичну систему витримують у трьох температурних режимах: після змішування компо­нентів - при кімнатній температурі протягом 15 хв., при температурі 4 °С (у холодильнику) протягом 13-18 годин, після чого підігрівають протягом 15 хв. на водяній бані (37 °С) і вносять гемолітичну систему. Залишають, як і при постановці РЗК, на водяній бані і враховують ре­зультати реакції. РТЗК вважають більш "чутливою". її рекомендовано для діагностики туберкульозу, кампілобактеріозу, бруцельозу та ін.

 

 

ЗМІСТ

Види патентного пошуку. ………………………………………………….. 3

2. Патентні дослідження. ……………………………………………………… 5

 

Список використаної лiтератури ………………………………...……………. 12