Дочерние компанииИзотонический 0,85% раствор хлористого натрия (физиологический раствор). 0,85 г хлористого натрия: растворяют в 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 121±1 °С в течение 15 мин. Хранят при комнатной температуре не более 14 сут. Раствор фенолового красного вмассовой концентрации 1%: 0,1 г фенолового красного растирают, добавляя небольшими порциями 2,82 мл 0,1 М раствора натрия гидроокиси и 20 мл 96% спирта. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Хранят во флаконе из темного стекла в холодильнике при температуре +4…–10 °С в течение 7 сут. Реактивы для проведения оксидазного теста: Вариант 1: 1%-й водный раствор тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорида. Готовят перед употреблением. Вариант 2. Реактив № 1: 1%-й спиртовой раствор α-нафтола; реактив № 2: 1%-й водный раствор фенилендиаминового соединения. Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками: первый — до 1 мес., второй — до 1 недели. Перед употреблением к 3 частям первого раствора добавляют 7 частей второго раствора. Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или аналоги). 2 Методы исследования 2.1 Методы исследования питьевой воды 2.1.1 Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре. Определение понятия показателя Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (далее - ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза. Выполнение анализа Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл. После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8-12) мл (на чашку диаметром 90-100 мм) расплавленного и остуженного до (45-49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара. Расплавленный агар на период проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие температуру (45-49) °С. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24 ±2) ч. У чет результатов Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (далее - КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды. Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают “число КОЕ/ мл - ориентировочно”. Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают “сплошной рост”. 2.1.2 Определение общих колиформных бактерий (далее – ОКБ) и термотолетарных колиформных (далее – ТКБ) бактерий титрационным методом Титрационный метод может быть использован: - при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации; - при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ; - в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий. Принцип метода Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам. Выполнение анализа При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 мл. При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл. Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п.5.5. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации. Посевы инкубируют при (37 ± 1) °С в течение 48 ч. Не ранее 24 час. инкубации проводят предварительную оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (п. 5.4.1) для получения изолированных колоний. Емкости без наличия роста и образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение (18-20) ч. При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы. Наличие ОКБ требуется подтвердить: - если в среде накопления отмечено только помутнение; - если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя. В этих случаях: - проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии; - выполняют оксидазный тест; - подтверждают принадлежность к Граму; - подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по п. 5.6 с последующей инкубацией посевов при температуре (37 ± 1) °С в течение (24-48) ч. При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими методами. Отрицательный ответ дают, если: - в среде накопления нет признаков роста; - на секторах среды Эндо нет роста; - на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т. п.); - все колонии оказались оксидазоположительными; - все колонии оказались грамположителъными; - если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообразования. Для определения ТКБ работают с секторами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред, приготовленных по п. 5.6. Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при температуре (44 ± 0,5) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через (4-6) ч. При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ. Допустимо для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с лактозо-пептонной средой с поплавком по п. 5.6 и прогретой предварительно до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44±0,5)°С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. Учет результатов При исследовании 3 объемов по 100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в протоколе “обнаружены в 100 мл”. При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (далее - НВЧ) ОКБ и ТКБ. Результат сообщают без доверительного интервала. При отрицательном ответе на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе “не обнаружены в 100 мл”. 2.2 Методы исследования на стерильность Определение бактерии группы кишечной палочки (далее – БГКП). К БГКП относятся факультативно-анаэробные, грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу (глюкозу) с образованием кислоты и газа при (37 + 1)0С в течение 24-48 часов, в основном, являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.е. учитываются цитратположительные и цитратотрицательные варианты БГКП). Для выявления БГКП производят посев на среду обогащения, для чего тампон (марлевую салфетку) погружают в 10-20% желчный бульон или среду Кесслера. Через сутки инкубирования при (37 + 1)0С делают пересев на среду Эндо. При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для БГКП (красных и темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых или бледно-розовых), выдают заключение об отсутствии БГКП. При наличии на среде Эндо характерных колоний из них готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют; выполняют пробу на оксидазу. Наличие в мазках грамотрицательных, оксидазоотрицательных палочек предполагает присутствие БГКП. Исследуемые колонии засевают на среду Гисса с лактозой или глюкозой. Инкубируют (37 + 1)0С 24 часа. Первичный учет проводят через 4-6ч. При обнаружении кислоты и газа выдают положительный ответ. При выявлении на среде Эндо мелких бесцветных колоний, подозрительных на наличие возбудителей кишечных инфекций, колонии снимают и изучают на принадлежность к патогенным микроорганизмам семейства Enterobacteriaceae. Определение синегнойной палочки. Синегнойная палочка грамотрицательная, облигатно-аэробная, не образующая спор палочка, оксидазоположительная, образующая сине-зеленый пигмент. Для выявления синегнойной палочки из среды Кесслера делают пересев на мясопептонный агар (далее – МПА) с фурагином, термостатируют (37 + 1)0С в течение 48 часов. Колонии синегнойной палочки плоские, сине-зеленого цвета со специфическим ароматическим цветочным запахом. На среде Эндо колонии плоские, с неровными краями, от бледно-сиреневого, до темно-сиреневого цвета. Дифференциальным признаком синегнойной палочки является ее способность окислять глюкозу в аэробных условиях и отсутствие таковой в анаэробных. Для этого исследуемую культуру засевают в 2 пробирки с 4 мл среды Хью-Лейфсона или полужидкой среды Гисса с глюкозой, в одну из которых вносится 0,5 мл вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 + 1)0С до 4-х суток, ежедневно учитывается результат посева. Изменение цвета среды в пробирке без вазелинового масла свидетельствует об окислении глюкозы. 2.3 Методы исследования воды из чаши бассейна 2.2.1 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации. Сущность метода. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранный фильтр, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. К общим колиформным бактериям (далее — ОКБ) относят грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37±1 °С в течение 24– 48 ч. К термотолерантным колиформным бактериям (далее — ТКБ) относят бактерии, обладающие признаками общих колиформных бактерий, а также способные ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44±0,5 °С в течение 24±2 ч. Выполнение анализа. Для исследования воды плавательных бассейнов анализируют объем воды 100 мл. Отмеренный объем воды фильтруют через мембранный фильтр с соблюдением требований главы 5 настоящей Инструкции. Фильтр помещают на среду Эндо, чашку с фильтром ставят в термостат, посев инкубируют при 37±1 °С в течение 24±2 ч. Если на фильтре нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, расплывчатые, то выдают отрицательный ответ: «отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл». Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на оборотной стороне фильтра, необходимо их подтверждение для отнесения к ОКБ и ТКБ. Для подтверждения наличия ОКБ исследуют все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний или не менее 3–4 колоний каждого типа. Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не менее 10. Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на наличие оксидазной активности и определяют грампринадлежность (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена), также проверяют способность культуры ферментировать лактозу до кислоты и газа. Постановка оксидазного теста Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2–3 каплями реактива для оксидазного теста. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированных колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое (вариант 1) или синее (вариант 2) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают. Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют. Если на части или на всей поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков реакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от применяемого реактива) оксидазный тест считают положительным. Если все колонии на фильтре оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ, анализ завершают, отмечают «зарост фильтров». В обоих случаях анализ повторяют. При отрицательной оксидазной реакции делают рассев для получения изолированных колоний и подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по соответствующим пунктам настоящей Инструкции. Определение грам-принадлежности Из оксидазоотрицательной колонии делают мазок и окрашивают по Граму. На обезжиренное спиртом предметное стекло наносят петлей 1 каплю дистиллированной воды, вносят небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по поверхности стекла. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового, через 0,5–1 мин бумагу снимают. Наливают раствор Люголя на 0,5–1 мин, затем сливают его и промывают стекло этиловым спиртом, пока не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и докрашивают в течение 1–2 мин раствором фуксина или сафранина. Стекло промывают и просушивают фильтровальной бумагой. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Грамотрицательные микроорганизмы имеют розовую окраску, грамположительные — сине-фиолетовую. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками. Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена. В капле 3%-го водного раствора гидроокиси калия на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется. Если за петлей тянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются — реакция отрицательная. Определение ферментации лактозы Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой. Для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 48 ч. Для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно подогретую до 43–44 °С, и инкубируют при температуре 44±0,5 °С в течение 24 ч. Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ возможен через 4–6 ч. При обнаружении кислоты и газа выдают положительный ответ. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата оставляют для окончательного учета до 48 ч. Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, то ее пересевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение 18–24 ч выполняют все необходимые подтверждающие тесты. Обработка и выражение результатов Грамотрицательные колонии учитывают как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при 37±1 °С с образованием кислоты и газа. Грамотрицательные колонии учитывают как ТКБ в отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при 44±0,5 °С с образованием кислоты и газа. При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах выдают ответ «не обнаружено ОКБ в 100 мл» и «не обнаружено ТКБ в 100 мл». Ориентировочный результат может быть выдан при обнаружении типичных колиформных колоний на среде Эндо, образованных грамотрицательными оксидазоотрицательными бактериями. Окончательный ответ подтверждают по результатам теста ферментации лактозы. При наложении колоний или сплошном росте на всех фильтрах в случае подтверждения принадлежности к ОКБ и ТКБ выдают качественный ответ «обнаружены в 100 мл». 2.2.2 Определение S. аureus прямым методом Сущность метода Прямой метод основан на фильтровании установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на селективно- дифференциальных средах для культивирования стафилококков и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам. Проведение анализа Объем воды 100 мл фильтруют через мембранный фильтр. Фильтр помещают на плотные среды: желточно-солевой агар, агар Байрд-Паркер, маннитно-солевой агар. Чашку с фильтром ставят в термостат дном вверх, посев инкубируют при 37±1 °С в течение 24–48 ч. После 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посевов; дальнейшая инкубация в течение 24 ч возможна при комнатной температуре. Идентификация S. aureus Если при использовании среды Байрд-Паркер на фильтре выросли колонии черного или темно-серого цвета диаметром 1–3 мм, окруженные двойной зоной протеолитической и липазной активности, то подтверждение принадлежности этих колоний к S. аureus устанавливать не обязательно. Если при использовании желточно-солевых сред выросли блестящие выпуклые колонии белого, палевого, золотистого цвета, окруженные радужной с перламутровым блеском зоной, необходимо подтверждение их принадлежности к S. аureus. Для подтверждения принадлежности подозрительных колоний к S. аureus с целью накопления чистой культуры делают пересев подозрительных колоний на поверхность скошенного питательного агара. Посев инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 22±2 ч. С чистой культурой проводят ряд дополнительных тестов. Определяют грампринадлежность исследуемых колоний. S. аureus является грамположительным кокком. Определяют ферментацию маннита или мальтозы в анаэробных условиях: делают посев уколом в среду с маннитом (мальтозой). Инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 24–48 ч. S. аureus ферментирует маннит (мальтозу) в анаэробных условиях, что приводит к изменению цвета среды. Проводят исследование фермента плазмокоагулазы. Для проведения реакции сухую кроличью цитратную плазму разводят согласно рекомендации по применению и разливают по 0,5 мл в 4 стерильные пробирки. В пробирки с раствором плазмы вносят по одной петле исследуемой суточной культуры и инкубируют при температуре 37±1 °С в течение 4–6 ч. Обязательна постановка двух параллельных контролей: первый контроль — пробирка только с раствором плазмы; второй контроль — пробирка с раствором плазмы, в которую внесена суточная культура стафилококка, заведомо обладающего ферментом коагулазой. Если в эти сроки не наблюдается свертывание плазмы в опытной и первой контрольной пробирках, то реакция плазмокоагуляции считается отрицательной; если плазма в опытной пробирке коагулирована аналогично второму контролю, то реакция считается положительной. Обработка и выражение результатов Если на фильтрах и чашках с высевом со среды обогащения нет роста, обнаружен рост нехарактерных колоний или не подтвердилась принадлежность подозрительных колоний к S. аureus, выдают отрицательный ответ «не обнаружены лецитиназоположительные стафилококки в 100 мл». В случае идентификации подозрительных колоний как S. аureus выдают положительный ответ: «обнаружены лецитиназоположительные стафилококки в 100 мл» 3. Периодичность отбора проб Периодичность отбора проб из источников централизованного водоснабжения, воды из чаши бассейнов и смывов на стерилность устанавливается программой производственного контроля предприятий, разработанной в соответствии с СанПиН 10-124 РБ 99[1], санитарных правил №117 [5], СанПиН № 105[2], Инструкцией 4.2.10-22-1-2006 [8]. Отбор проб воды из источников нецентрализованного водоснабжения осуществляется по желанию граждан и при ежеквартальном мониторинге из утвержденных Главным государственным санитарным врачом Минского района мониторинговых точек. 4. Результаты исследований В ходе практики были проверены пробы питьевой воды из источников централизованного и нецентрализованного водоснабжения на соответствие СанПиН 10-124 РБ 99[1] и СанПиН №105 [2] соответственно, вода из чаши бассейна на соответствие требованиям инструкции по применению «Методы санитарно-микробиологического контроля воды плавательных бассейнов» [6], а так же был произведен посев смывов с медицинского инструмента. В ходе прохождения практики было отобрано 12 проб питьевой воды из источников нецентрализованного водоснабжения и проведено исследование на соответствие СанПиН «Гигиенические требования к источникам нецентрализованного питьевого водоснабжения населения»[2], результаты приведены в таблице 5. Таблица 5 – Результаты исследования проб питьевой воды из источников нецентрализованного водоснабжения.
В ходе прохождения практики было отобрано 25 проб питьевой воды из источников централизованного водоснабжения и проведено исследование на соответствие СанПиН 10-124 РБ 99[1], результаты приведены в таблице 6. Таблица 6 – Результаты исследования проб питьевой воды из источников централизованного водоснабжения.
В ходе прохождения практики было отобрано 5 проб воды из чаши бассейна и проведено исследование на соответствие инструкция по применению «Методы санитарно-микробиологического контроля воды плавательных бассейнов» [3], результаты приведены в таблице 7.
Таблица 7 – Результаты исследования проб воды из чаши бассейна.
ВЫВОДЫ: 1. Исследования 12 проб питьевой воды из источников нецентрализованного водоснабжения показали, что все пробы соответствовали нормам; 2. Исследования 25 проб питьевой воды из источников централизованного водоснабжения показали, что все пробы соответствовали нормам; 3.Исследования 5 проб воды из чаши бассейна показали, что все пробы соответствовали нормам.
ЛИТЕРАТУРА: 1. СанПиН 10-124 РБ 99 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», утвержденные постановлением главного государственного санитарного врача №46 от 19.10.1999 года, с изменениями и дополнениями от 26.03.2002 года №46; 2. СанПиН «Гигиенические требования к источникам нецентрализованного питьевого водоснабжения населения», утвержденные Постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь №105 от 02.08.2010г; 3. инструкция по применению «Методы санитарно-микробиологического контроля воды плавательных бассейнов», утвержденная Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 19.03.10г; 4. Методические указания МУК РБ №11-10-1-2002 «Санитарно - микробио
|
