Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение). Методы культивирования анаэробов

Дыхание, или биологическое окисление, основано на окисли­тельно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление — отдача донорами (молекулами или атомами) во­дорода или электронов; восстановление — присоединение водо­рода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным — нитратным, сульфатным, фумаратным).

Анаэробиоз (от греч. аег — воздух + bios — жизнь) — жизнедеятельность, протекающая при отсутствии сво­бодного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода яв­ляются органические соединения, то такой процесс называется брожением. При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязатель­ные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

Методы культивирования анаэробов.

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, соз­дать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и био­логических методов.

Физические методы. Основаны на выращивании мик­роорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в ко­торых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно использу­ют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кис­лород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содер­жание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают сверху небольшим количеством стерильного вазе­линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глю­козу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующи­ми веществами является среда Китта — Тароцци, кото­рая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа­метром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка­пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капилляр­ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде­ления отдельной колонии трубку надрезают напильни­ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло­мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней­шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо­го откачивания из специальных приборов — анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен­ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш­кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во­дородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кисло­рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na₂S20₄.

Биологические методы. Основаны на совместном вы­ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири­ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе­вают аэроб, например, часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана­эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно­жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост­ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш­ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи­зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.