Радиоиммунный анализ: принципы, вид, основные этапы исследования, приборы. Применение в КДЛ

Радиоиммунный анализ (РИА), также радиоиммунологический или изотопный иммунологический анализ, (англ. Radioimmunoassay, RIA) — метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами (чаще всего с АТ), с последующей детекцией на специальных счетчиках — радиоспектрометрах.

Впервые метод был разработан Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу в 1950-х годах. С помощью этого метода они изучали клиренс инсулина у больных диабетом. Р. Ялоу получила за это Нобелевскую премию в 1977 году.

Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода ¹²⁵I, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность.

В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а. выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

Радиоиммунный анализ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Так, например, с помощью коммерческого набора фирмы “ЭББОТТ” — Австрия II-I¹²⁵ удается выявлять HBsAg в концентрациях до 0,1 нг/мл. К преимуществам метода можно отнести возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Диагностические наборы для выявления различных антигенов вирусов гепатитов А, В и D и антител к ним выпускаются фирмой “Изотоп” (Ташкент) и некоторыми зарубежными фирмами (например, фирмой “ЭББОТТ”). В качестве твердой фазы применяются полистироловые шарики (“ЭББОТТ”) или пробирки (“Изотоп”). Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп I¹²⁵, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Измерение радиоактивной метки, т. е. излучения, проводится на специальных счетчиках — радиоспектрометрах. Подсчет радиоактивных импульсов как в контрольных, так и исследуемых образцах проводится в единое фиксированное время, обычно в течение 1 минуты. При анализе результатов реакции необходимо учитывать наличие фона радиоактивности, который может влиять на конечный результат реакции. Причинами повышенного фона могут быть: загрязнение контейнера или гнезда для пробы; неправильная настройка прибора; наличие источника сильного излучения вблизи прибора.

Для подтверждения положительного результата, полученного при первичном скрининге образцов, рекомендуется повторное исследование РИА или в альтернативном тесте. При обнаружении HBsAg необходимо проводить конфирмационный тест.

Радиоиммунный анализ - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.

Метод применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов.

 

Хроматография: теоретические основы, принцип метода. Сорбенты и элюенты для хроматографического анализа. Методы проявления хроматограмм. Основные виды хроматографии: адсорбционная, ионообменная, гель-фильтрация, аффинная, ВЭЖХ. Аналитические характеристики, применение в клинике.

Хроматография (от греч. χρώμα — цвет) — метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении веществ между двумя фазами — неподвижной (твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе, сорбент) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент). Название метода связано с первыми экспериментами по хроматографии, в ходе которых разработчик метода Михаил Цвет разделял ярко окрашенные растительные пигменты. Хроматограмма — результат регистрирования зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени.

Основные виды хроматографи и. В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают следующие основные виды — адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную (молекулярно-ситовую) и осадочную.

Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью); распределительная хроматография — на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесённая на твёрдый макропористый носитель) и элюенте (следует иметь в виду, что при распределительном механизме разделения на перемещение зон компонентов частичное влияние оказывает и адсорбционное взаимодействие анализируемых компонентов с твёрдым сорбентом); ионообменная хроматография — на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси; эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография — на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Эксклюзионная хроматография подразделяется на гель-проникающую (ГПХ), в которой элюент — неводный растворитель, и гель-фильтрацию, где элюент — вода. Осадочная Х, основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе.

В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают газовую и жидкостную Х. В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы газовая Х бывает газо-адсорбционной (неподвижная фаза — твёрдый адсорбент) и газожидкостной (неподвижная фаза — жидкость), а жидкостная Х — жидкостно-адсорбционной (или твёрдо-жидкостной) и жидкостно-жидкостной. Последняя, как и газо-жидкостная, является распределительной Х. К твёрдо-жидкостной Х относятся тонкослойная и бумажная.

Различают колоночную и плоскостную Х. В колоночной сорбентом заполняют специальные трубки — колонки, а подвижная фаза движется внутри колонки благодаря перепаду давления. Разновидность колоночной Х — капиллярная, когда тонкий слой сорбента наносится на внутренние стенки капиллярной трубки. Плоскостная Х подразделяется на тонкослойную и бумажную. В тонкослойной Х тонкий слой гранулированного сорбента или пористая плёнка наносится на стеклянную или металлическую пластинки; в случае бумажной Х используют специальную хроматографическую бумагу. В плоскостной Х перемещение подвижной фазы происходит благодаря капиллярным силам.

При хроматографировании возможно изменение по заданной программе температуры, состава элюента, скорости его протекания и др. параметров.

В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают следующие варианты Х: фронтальный, проявительный и вытеснительный. При фронтальном варианте в слой сорбента непрерывно вводится разделяемая смесь, состоящая из газа-носителя и разделяемых компонентов, например 1, 2, 3, 4, которая сама является подвижной фазой. Через некоторое время после начала процесса наименее сорбируемый компонент (например, 1) опережает остальные и выходит в виде зоны чистого вещества раньше всех, а за ним в порядке сорбируемости последовательно располагаются зоны смесей компонентов: 1 + 2, 1 + 2 + 3, 1 + 2 + 3 + 4. При проявительном варианте через слой сорбента непрерывно проходит поток элюента и периодически в слой сорбента вводится разделяемая смесь веществ. Через определённое время происходит деление исходной смеси на чистые вещества, располагающиеся отдельными зонами на сорбенте, между которыми находятся зоны элюента. При вытеснительном варианте в сорбент вводится разделяемая смесь, а затем поток газа-носителя, содержащего вытеснитель (элюент), при движении которого смесь через некоторый период времени разделится на зоны чистых веществ, между которыми окажутся зоны их смеси. Ряд видов Х осуществляется с помощью приборов, называемых хроматографами, в большинстве из которых реализуется проявительный вариант Х. Хроматографы используют для анализа и для препаративного (в т. ч. промышленного) разделения смесей веществ. При анализе разделённые в колонке хроматографа вещества вместе с элюентом попадают через различные промежутки времени в установленное на выходе из хроматографической колонки детектирующее устройство, регистрирующее их концентрации во времени. Полученную в результате этого выходную кривую называют хроматограммой. Для качественного хроматографического анализа определяют время от момента ввода пробы до выхода каждого компонента из колонки при данной температуре и при использовании определённого элюента. Для количественного анализа определяют высоты или площади хроматографических пиков с учётом коэффициентов чувствительности используемого детектирующего устройства к анализируемым веществам.

Для анализа и разделения веществ, переходящих без разложения в парообразное состояние, наибольшее применение получила газовая хроматография, где в качестве элюента (газа-носителя) используются гелий, азот, аргон и др. газы. Для газо-адсорбционного варианта Х в качестве сорбента (частицы диаметром 0,1—0,5 мм)используют силикагели, алюмогели, молекулярные сита, пористые полимеры и др. сорбенты с удельной поверхностью 5—500 м²/г. Для газо-жидкостной Х сорбент готовят нанесением жидкости в виде плёнки (высококипящие углеводороды, сложные эфиры, силоксаны и др.) толщиной несколько мкм на твёрдый носитель с удельной поверхностью 0,5—5 м²/г и более. Рабочие температурные пределы для газо-адсорбционного варианта Х от —70 до 600 °С, для газо-жидкостного от —20 до 400 °С. Газовой Х можно разделить несколько см³ газа или мг жидких (твёрдых) веществ; время анализа от нескольких сек до нескольких часов.

В жидкостной колоночной Х в качестве элюента применяют легколетучие растворители (например, углеводороды, эфиры, спирты), а в качестве неподвижной фазы — силикагели (в т. ч. силикагели с химически привитыми к поверхности различными функциональными группами — эфирными, спиртовыми и др.), алюмогели, пористые стекла; размер частиц всех этих сорбентов несколько мкм. Подавая элюент под давлением до 50 Мн/м² (500 кгс/см²), удаётся сократить время анализа от 2—3 ч до нескольких мин. Для повышения эффективности разделения сложных смесей используют программируемое во времени изменение свойств элюента путём смешения растворителей разной полярности (градиентное элюирование).

В тонкослойной и бумажной Х исследуемую смесь в жидком виде наносят на стартовую линию (начало пластинки или полоски бумаги), а затем разделяют на компоненты восходящим или нисходящим потоком элюента. Последующее обнаружение (проявление) разделённых веществ на хроматограмме (так в этих случаях называют пластину с нанесённым на неё сорбентом или хроматографическую бумагу, на которых произошло разделение исследуемой смеси на компоненты) осуществляют при помощи ультрафиолетовой (УФ) спектроскопии, инфракрасной (ИК) спектроскопии или обработкой реактивами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные соединения.

Качественно состав смесей с помощью этих видов Х характеризуют определённой скоростью перемещения пятен веществ относительно скорости движения растворителя в данных условиях. Количественный анализ осуществляют измерением интенсивности окраски вещества на хроматограмме.

Хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа многокомпонентных систем, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного (в т. ч. промышленного) выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов.
Газовая Хроматография применяется для газов разделения, определения примесей вредных веществ в воздухе, воде, почве, промышленных продуктах; определения состава продуктов основного органического и нефтехимического синтеза, выхлопных газов, лекарственных препаратов, а также в криминалистике и т.д. Разработаны аппаратура и методики анализа газов в космических кораблях, анализа атмосферы Марса, идентификации органических веществ в лунных породах и т.п.
Газовая Хроматография применяется также для определения физико-химических характеристик индивидуальных соединений: теплоты адсорбции и растворения, энтальпии, энтропии, констант равновесия и комплексообразования; для твёрдых веществ этот метод позволяет измерить удельную поверхность, пористость, каталитическую активность.
Жидкостная Хроматография используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10^-11—10^{-9 г} ), что исключительно важно в биологических исследованиях. Часто применяется молекулярно-ситовая Хроматография и Хроматография по сродству; последняя основана на способности молекул биологических веществ избирательно связываться друг с другом.
Тонкослойная и бумажная Хроматография используются для анализа жиров, углеводов, белков и др. природных веществ и неорганических соединений.
В некоторых случаях для идентификации веществ используется Хроматография в сочетании с др. физико-химическими и физическими методами, например с масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др. Для расшифровки хроматограмм и выбора условий опыта применяют ЭВМ.