Приложение 2. Для подтверждения связи заболевания с патогенными стрептококками и полноты выздоровления наряду с бактериологическими исследованиями проводят иммунологические

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИСТРЕПТОЛИЗИНА-О (АEstO)

 

Для подтверждения связи заболевания с патогенными стрептококками и полноты выздоровления наряду с бактериологическими исследованиями проводят иммунологические исследования.

Одним из чувствительных иммунологических методов диагностики при заболеваниях стрептококковой природы является определение в сыворотках крови больных титра анти-стрептолизина-О. Для проведения исследования используют парные сыворотки больных, взятые в начале заболевания и после выздоровления.

1. Препарат стрептолизина-О. Высушенный лиофильным методом препарат стрептолизина-О, содержащий восстановитель, непосредственно перед добавлением в пробирки растворяют в фосфатном буфере рН= 6,5-6,7, исходя из данных, указанных на этикетке. Разведенный таким образом препарат стрептолизина-О должен содержать в объеме 0,3 мл одну рабочую дозу, т.е. количество стрептолизина-О, которое почти полностью (++) нейтрализуется половиной международной единицы анти-стрептолизина-О стандарта ГКИ.

2.Фосфатный буфер рН= 6,5-6,7. На один литр дистиллированной воды добавляют 7,4 г NaCl; 3,17 г КН2РО4, 1,81 г NaНРО4х2Н2О и NaОН до рН= 6,5-6,7. Хранят буфер при температуре 4-10^о С.

3. Взвесь эритроцитов. Дефибринированную кровь кролика, взятую из вены, наливают в центрифужные пробирки, отмечают уровень крови, центрифугируют и удаляют плазму. Эритроциты трехкратно промывают 0,85% раствором NaCl, взвесь тщательно размешивают и к 5 мл такой взвеси добавляют 95 мл фосфатного буфера рН= 6,5-6,7. Взвесь эритроцитов готовят в день постановки опыта.

4. Сыворотки больных. Кровь, взятую из пальца или локтевой вены больных в количестве не менее 0.5 мл, ставят на 15 мин в термостат, а затем в холодильник. Через 2-24 ч стояния при температуре 4-10^о С сыворотку отделяют от сгустка, прогревают 30 мин при температуре 56^о С и используют для титрования антител. Хилезные, гемолизированные и проросшие сыворотки не пригодны для титрования.

5. Разведение сывороток. Сыворотки больных разводят фосфатным буфером рН=6,5-6,7.

А. 1:50 плюс 2,0 мл буфера.

В. 1:1000 - 0,5 мл из разведения 1:250 плюс 1,5 мл буфера.

6. Титрование сыворотки. Разведенные сыворотки и другие ингредиенты разливают по пробиркам, как это указано в схеме титрования.

Титр сыворотки выражают числом АЕstО в 1 мл сыворотки. АЕstО-интернациональная единица анти-стрептолизина-О. В схеме титрования приведено число АЕstО в 1 мл при нейтрализации стрептолизина-О различными разведениями сыворотки.

Результаты титрования обозначают:

(+++) - положительная реакция - отсутствие гемолиза и в осадке эритроциты;

(++) - положительная реакция - частичный гемолиз;

((-) (+) - сомнительная реакция - почти полный гемолиз;

(-) - отрицательная реакция - полный гемолиз.

7. Контроль. Пробирки 12-я и 13-я служат для контроля эритроцитов и стрептолизина-О. Эритроциты не должны при учете реакции быть гемолизированы. Стрептолизин-О должен в дозе 0,3 мл рабочего разведения вызывать полный гемолиз 0,2 мл 5% взвеси эритроцитов кролика.

8. Оценка полученных результатов. Титр анти-стрептолизина-О до 250 АЕstО в 1мл обнаруживается у практически здоровых людей (титры анти-стрептолизина-О приведены в интернациональных единицах). Повышенные титры анти-стрептолизина-О обнаруживаются при ряде острых и хронических стрептококковых заболеваний (скарлатина, ангина, ревматизм, нефрит и др.). Повышение этих антител является показателем перенесенной стрептококковой инфекции. Особенно высоких титров достигают эти антитела при ревматизме и нефрите. Характерной особенностью этих двух заболеваний является обнаружение анти-стрептолизина-О в высоких титрах (500 АЕstO и выше) с первых дней заболевания, что может быть использовано в целях вспомогательного метода диагностики.

Таблица 2

 

Схема титрования антистрептолизина-О в сыворотках

	Разведения сыворотки	Контроль
	1:50	1:250	1:1000
Номер пробирки
Дозы сыворотки, мл	0,4	0,2	0,15	0,1	0,4	0,3	0,25	0,2	0,1	0,25	0,15	-	-
Фосфатный буфер рН= 6,5-6,7	0,1	0,3	0,35	0,4	0,1	0,2	0,25	0,3	0,4	0,25	0,35	0,8	0,5
Стрептолизин	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3	-	0,3
Термостат 15 мин 37оС
5% взвесь эритроцитов, мл	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Термостат 1 ч мин 37оС
Число интернациональных единиц в 1 мл												Контроль

 

 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГИАЛУРОНИДАЗЫ (AEHyS)

 

Определение антигиалуронидазы проводят так же, как и антистрептолизина-О, с имеющимся в продаже антигеном - высушенным фильтратом культуры стрептококка. Перед употреблением лиофилизированный препарат гиалуронидазы растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия соответственно указанию на этикетке. В этом разведении антиген должен содержать одну опытную дозу в 0,2 мл. Кровь для исследования берут у больного из пальца или из вены в количестве не менее 0,5 мл, дают ей отстояться в термостате и в холодильнике, после чего отсасывают сыворотку и инактивируют ее при 56^о С 30 мин.

Готовят рабочую дозу гиалуроновой кислоты - то ее количество, которое при добавлении 15% раствора уксусной кислоты в состоянии образовывать отчетливый сгусток при полном просветлении среды. Рабочая доза раствора гиалуроновой кислоты должна быть равна 0,2-0,3 мл. Определяют рабочую дозу перед каждой постановкой опыта. Схема постановки опыта представлена в таблице. За единицу антигиалуронидазы принимают то минимальное количество сыворотки, которое нейтрализует 1 опытную дозу гиалуронидазы. Таким образом, титр изучаемой сыворотки выражают в единицах антигиалуронидазы на 1 мл сыворотки.

 

Схема титрования антигиалуронидазы в сыворотках

таблица 3

 

	Разведения сыворотки	Контроль
	1:50	1:250	1:1000
Номер пробирки
Дозы сыворотки, мл	0,4	0,2	0,15	0,1	0,4	0,3	0,25	0,2	0,1	0,25	0,15	-	-
Фосфатный буфер рН= 6,5-6,7	0,1	0,3	0,35	0,4	0,1	0,2	0,25	0,3	0,4	0,25	0,35	0,5	0,5
Стрептолизин, мл	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Термостат 30 мин 37оС
Гиалуроновая кислота	Всюду по одной рабочей дозе 30 мин при 37оС, 10 мин при 4оС (холодильник)
15% раствор уксусной кислоты	Всюду по 3 капли
Число международных единиц антигиалуронидазы в 1 мл												Контроль