Модель Моно-Шанже-Уайман

В 1965 г. Жак Моно, Джефри Уайман и Жан-Пьер Шанже предложили изящное объяснение кооперативности аллостерических ферментов. Используя их подход, рассмотрим аллостерический фермент, состоящий из двух идентичных субъединиц, каждая с одним активным центром. Субъединицы могут находиться в двух конформациях - R- (relaxed - "расслабленном")-состоянии и T (tense, "напряженном")-состоянии. Конформация R обладает высоким сродством к субстрату, Т- низким (рис. 9.1). Формы R и T могут переходить одна в другую. В данной модели делается важное допущение, что для сохранения симметрии димера обе субъединицы должны находиться в одном и том же конформационном состоянии. Т. е., разрешены состояния RR и TT, состояние RT запрещено. Сделаем еще одно допущение: пусть субстрат может присоединяться только к R-форме фермента. R-форму, связанную с 1 молекулой субстрата обозначим R₁, связанную с 2 молекулами R ₂. Присоединение каждой молекулы субстрата характеризуется одной и той же микроскопической константой диссоциации К_R. Тогда можно записать следующие соотношения: R₀ + S <=> R₁, R₁ + S <=> R₂.Присоединение первой молекулы субстрата сопровождается переходом ТТ-формы с низким сродством к субстрату в RR-форму с высоким сродством.

Рассмотрим процесс связывания. В отсутствие субстрата почти все молекулы фермента находятся в Т-форме. В примере, показанном на рис. 9.2, на 10⁴ молекул в Т-форме приходится только одна молекула в R-форме. Добавление субстрата сдвигает конформационное равновесие в сторону образования R-формы, поскольку именно R-форма связывает субстрат. Когда субстрат присоединяется к одному активному центру, второй активный центр должен быть также в R-форме, согласно основному постулату данной модели. Другими словами, переход от Т к R и обратно все субъединицы фермента осуществляют согласованно. Следовательно, по мере добавления субстрата доля молекул фермента в R-форме прогрессивно возрастает, и связывание субстрата происходит кооперативно.

На основе модели согласованного механизма нетрудно объяснить влияние аллостерических ингибиторов и активаторов. Аллостерический ингибитор связывается преимущественно с Т-формой, тогда как аллостерический активатор связывается преимущественно с R-формой. Следовательно, аллостерический ингибитор сдвигает конформационное равновесие R ⇔ T в сторону Т, а аллостерический активатор - в сторону R. Эти эффекты можно выразить количественно через изменение константы аллостерического равновесия L. Аллостерический ингибитор повышает величину L, тогда как аллостерический активатор понижает ее. Эти влияния показаны на рис. 9.2. Степень насыщения У при всех значениях [S] снижается в присутствии ингибитора и повышается в присутствии активатора.

 

Билет 15.

1. Колориметрические методы контроля ферментативной реакции. Примеры.

Первая группа методов основана на взаимодействии белка с ионами меди в щелочной среде. К ним относятся несколько методов, в которых используется биуретовый реактив в вариантах для концентрированных белковых растворов и более разбавленных, а также несколько разновидностей метода Лоури. Колориметрические методы этой группы принято считать наиболее корректными, потому что концентрация окрашенных комплексов и, соответственно, интенсивность окраски пропорциональны числу пептидных связей. Окраска белкового комплекса обычно стабильна в течение длительного времени (около часа).

Вторую группу колорим методов составляют методы, основанные на взаимодействии положительно заряженных амко белков с разнообразными по химической структуре кислыми красителями.

В отличие от спектрофо-х колориме-е методы требуют более значительных затрат времени, так как образование цветных комплексов белка с теми или иными реактивами не происходит мгновенно, в процессе проведения анализа происходит деструкция исследуемого белка, поскольку красители образуют с белками прочные связи. В то же время объем пробы, необходимый для проведения анализа, как правило, невелик. В целом эти методы обладают большей чувствительностью и помехоустойчивостью вследствие того, что при взаимодействии красителей с белками образуются специфические комплексы с очень интенсивным окрашиванием.

В большинстве таких методов для получения количественной оценки результата необходимо построение калибровочного графика или применение вычислительной техники. В идеальном варианте в качестве стандарта для построения калибровочного графика используют раствор исследуемого белка или раствор смеси белков, идентичный по составу анализируемому образцу. При невозможности выполнить это требование, большинство исследователей строят калибровочные графики, используя в качестве стандарта БСА.

2. Механизмы ферментативного катализа. (см выше)

3. Полуцентровая реактивность олигомерных ферментов.

Билет 16.

1. Принципы классификации ферментов.

2. Линеаризация уравнения М-М.

3. Наблюдение за ходом креатинкиназной реакции с помощью сопряженной системы Росалки.

Билет 17.

1. Механизмы двусубстратных реакций. (см выше)

2. Классификация трансфераз.

Катализируют перенос функциональных групп от одного соединения к другому. Подразделяют в зависимости от переносимой группы. Систематическое название составляется по форме «донор: транспортируемая группа – трансфераза». Например, для мевалонаткиназы -ATP:мевалонат 5- фосфотрансфераза. К классу трансфераз относят аминотрансферазы, ацилтрансферазы, метилтранс-феразы, гликозилтрансферазы, киназы (фосфо-трансферазы).

В настоящее время представленные в белковых базах данных киназы разбиты на 25 семейств гомологичных киназ, которые сгруппированы в 12 суперсемейств (групп), отличающихся по типу фолдинга белковой молекулы. В белковых базах данных в основе структурной классификации на суперсемейства киназ, имеющих глициновые петли для связывание нуклеотидов, лежат особенности структуры мотивов фланкирующих остатки глицина и расположение консенсусных мотивов внутри белковой молекулы. Одной из наиболее многочисленных групп являются суперсемейства киназ (и других нуклеотидсвязывающих белков), построенных на основе α β сандвича в различных модификациях, первоначально обнаруженный Россманом как специфический тип фолдинга для динуклеотидсвязывающих белков. Содержащие характерные остатки глицина в петлевых структурах были обнаружены у ряда киназ, в частности, в так называемом семействе классических P-loop (содержащих фосфатные петли) киназ, по фолдингу отнесенных к группе Россман-подобных киназ.

Согласно международной классификации и номенклатуре ферментов трансферазы относятся ко 2 классу, в пределах которого выделяют девять подклассов.

3. Модели «изменяющейся центровой реактивности» олигомерных ферментов.