Студопедия — Отчет по лабораторной работе №6
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Отчет по лабораторной работе №6

 

 

Цели работы. Приборы и принадлежности.

Цель настоящей работы состоит в практическом овладении методом количественного флуориметрического анализа и приемами количественной оценки величин квантовых выходом фотохимических реакций в биологически значимых молекулах на примере триптофана в свободном состоянии и в составе белка.

 

Приборы и принадлежности:

  1. Флуориметр
  2. Ультрафиолевый облучатель.
  3. Кварцевая кювета для измерения интенсивности флуоресценции
  4. Водный раствор триптофана
  5. Водный раствор бычьего сывороточного альбумина

 

План проделанной работы.

1. Подготовительная работа с теоретическим материалом.

2. Изучение принципа работы с приборами.

3. Регистрация концентрационных зависимостей Jф для свободного триптофана и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в водных растворах.

4. Определение квантовых выходов фотолиза свободного триптофана в водном растворе и триптофановых остатков в составе молекулы бычьего сывороточного альбумина.

5. Подсчет и обработка результатов, с помощью программы Excel.

6. Написание выводов и отчета по проделанной лабораторной работе и полученным результатам.

 

Теоретическое введение.

Флуориметрический анализ весьма широко используется для количественного определения содержания веществ, способных к флуоресценции. Метод основан на регистрации собственного (первичного) или вторичного излучения света исследуемыми молекулами. Для того, чтобы можно было определить количество флуорофора (испускающего флуоресценцию вещества) в объекте, необходимо знать, как зависит интенсивность его флуоресценции от концентрации. эта зависимость имеет следующий вид:

 

где Jф – интенсивность флуоресценции исследуемого вещества; J0 – интенсивность падающего на образец возбуждающего света; k – коэффициент, отражающий чувствительность флуориметра, q – квантовый выход флуоресценции (доля поглощенных квантов, которые излучаются в виде квантов флуоресценции); e - молярный коэффициент поглощения флуорофора на длине волны возбуждающего света, с – молярная концентрация флуорофора в объекте, l –длина оптического пути. Произведение e с l = D, оптической плотности объекта, обусловленной флуорофором.

При малых концентрациях (и, следовательно, оптических плотностях) исследуемого флуорофора эта формула упрощается:

 

В общем случае зависимость Jф нелинейна (носит экспоненциальный характер). Линейная зависимость между концентрацией флуорофора в объекте и интенсивностью флуоресценции выполняется в очень ограниченных пределах оптической плотности, причем эти пределы для данного конкретного флуорофора, как правило, заранее неизвестны. Поэтому при решении количественной флуориметрической задачи измеряются калибровочные зависимости (Jф=f(c)) с использованием чистых растворов определяемого вещества с известной концентрацией, которые затем и используются для определения количества флуорофора в объекте. В биологических объектах очень часто имеют место явления, очень сильно влияющие на измеряемую величину Jф. Это экранировка возбуждающего света, реабсорбция флуоресценции, ее тушение, светорассеивание и неоднородное распределение исследуемого соединения по объему объекта. Применяется 3 основные схемы регистрации Jф, различающиеся углом между направлениями падения возбуждающего света J0 на объект, и регистрации квантов флуоресценции. Этот угол может быть (1) тупым; (2) 900; (3) 00

Регистрируемый фотосигнал при измерении флуоресценции будет складываться из собственно Jф, и квантов так называемого паразитного света.

 

Паразитный (или «рассеянный») свет складывается из следующих компонентов: (1) части излучения источника возбуждающего света в области флуоресценции исследуемого вещества, проходящей через монохроматор из-за его неидеальности; (2) света, возникающего из-за комбинационного рассеивания возбуждающего излучения (так называемый «красный спутник»; если излучение рассеивается молекулами воды, то это излучение смещено на 20-50 нм в длинноволновую сторону относительно длины волны возбуждающего света); (3) люминесценции кюветы и растворителя. Влияние на результаты флуориметрии компоненты (1) паразитного света будет особенно велико при угле между направлениями возбуждения и регистрации флуоресценции, равном 0о (схема 3 на рис. 1, называется также «регистрацией флуоресценции в проходящем свете»). Поэтому такая схема измерения Jф применяется очень редко. При применении схем (1) и (2) на рис. 1 влияние паразитного света будет значительно только при сильном светорассеивании в исследуемом объекте.

 

Эффект экранировки возбуждающего света наблюдается в тех случаях, когда в объекте, помимо исследуемого флуорофора, содержатся и другие вещества, способные поглощать возбуждающий свет. Для того, чтобы избежать этого, определяется поправочный коэффициент на экранировку возбуждающего излучения, dэ, с помощью которого затем корректируются измеренные величины Jф:

 

где Jф – интенсивность флуоресценции с поправкой на экранировку; Jф – измеренная интенсивность флуоресценции, D – оптическая плотность исследуемого флуорофора в объекте, а Dэ – суммарная оптическая плотность всех содержащихся в нем экранирующих возбуждающее излучение примесей.

 

Эффект реабсорбции квантов флуоресценции состоит в повторном поглощении этих квантов другими молекулами, присутствующими в объекте. Для получения истинной величины Jф измеренные значения интенсивности флуоресценции умножают на соответствующий dр. Собственно же dр определяется на каждой из длин волн по формуле:

 

Обозначения в этой формуле те же, что и формуле для расчета dэ,только Dэ заменено на Dp суммарную оптическую плотность всех реабсорбирующих флуоресценцию соединений.

 

Миграцией энергии называется безизлучательный перенос энергии электронного возбуждения с одной молекулы (донора) на другую (акцептор) на расстояния, превышающие межатомные, и не связанный с соударением молекул.

Для устранения миграции следует тем или иным способом увеличить расстояние между донором и акцептором – вероятность миграции энергии обратно пропорциональна этому расстоянию в 6-й степени.

 

Тушение флуоресценции – снижение величины Jф за счет падения q, вызванного воздействием молекул-тушителей.

 

Светорассеивание в мутных образцах также влияет на величину Jф.

 

Кинетический метод измерения квантового выхода фотохимических реакций

 

В основе практически всех фотобиологических процессов лежат фотохимические реакции в биологически значимых молекулах. При фотобиологических исследования часто бывает необходимо выяснить, насколько эффективно идет тот или иной фотохимический процесс в изучаемом объекте. Главной характеристикой эффективности индукции фотохимической реакции под действием излучения в той или иной молекуле является квантовый выход данной фотохимической реакции. Обозначим этот показатель j. По определению, j будет равен:

 

Или, что то же самое:

 

Для определения величины j наиболее удобно применять так называемый кинетический метод.

Суть приема состоит в том, что тем или иным образом исследуется зависимость от дозы излучения либо количества исходных (неразрушенных) молекул, либо количество молекул продукта исследуемой фотохимической реакции. Этот метод применим при соблюдении следующих граничных условий:

 

  • Рассматриваемая фотохимическая реакция является одноквантовой (одноударной), т.е. для полного превращения исходной молекулы в продукт реакции достаточно поглощения ею одного кванта действующего излучения.
  • Продукты рассматриваемой реакции квантов действующего излучения не поглощают в области облучения.

 

Если оба эти условия соблюдены, то вид дозовой зависимости количества исходного соединения в образце будет описываться формулой:

 

где N – количество молекул неразрушенного вещества в образце, облученном в дозе Е, а s - так называемое поперечное сечение фотолиза, которое есть произведение j на r (r - поперечное сечение поглощения молекул фотолизируемого соединения, численно r =3,8´10-21 e), N0 количество молекул вещества в исходном (необлученном) образце.

 

Если мы прологарифмируем обе части выражения (1), то получим следующий вид его представления:

 

Из уравнения (2) следует, что зависимость натурального логарифма отношения концентраций исследуемого вещества в образце после облучения в некоторой дозе Е (N) к его концентрации до начала облучения (N0) от дозы облучения Е носит линейный характер, причем коэффициентом пропорциональности служит величина поперечного сечения фотолиза. На практике тем или иным образом анализируется зависимость N=f(E), на основании полученных данных строится зависимость согласно уравнению (2), по этой зависимости определяется величина s, а затем по ее величине рассчитывается j, который равен:

 

 

 

Интенсивность флуоресценции триптофана
Конечная концентрация триптофана в образце мг/мл

 

Рис 1. Концентрационные зависимости интенсивности флуоресценции для триптофана в водном растворе. По оси ординат - интенсивность флуоресценции триптофана. По оси абсцисс - конечная концентрация триптофана в образце мг/мл

При концентрациях 0 мг/мл- 0,04 мг/мл график имеет линейную зависимость, при концентрации триптофана в образце 0,04 мг/мл мы измеряем фотолиз.

 

 

Интенсивность флуоресценции БСА
Конечная концентрация БСА в образце мг/мл  

 

Рис 2. Концентрационные зависимости интенсивности флуоресценции для БСА (бычий сывороточный альбумин) в водном растворе. По оси ординат - интенсивность флуоресценции БСА. По оси абсцисс - конечная концентрация БСА в образце мг/мл

При концентрации от 0-0,3 мг/мл график имеет линейную зависимость при концентрации БСА в образце 0,5 мг/мл мы измеряем фотолиз.

 

 

Доза излучения, квант*1019
ln (Jфлобл¤Jфл0)

Рис 3. Дозовые зависимости интенсивности флуоресценции триптофана в водном растворе. По оси абсцисс- доза излучения* 1019, по оси ординат- ln (Jфлобл¤Jфл0), Jфлобл - интенсивность флуоресценции раствора триптофана, облученный в разное время, Jфл0- интенсивность флуоресценции раствора триптофана необлученного.

 

Квантовый выход для триптофана j= 0,00083= 0,083%

 

ln (Jфлобл¤Jфл0)  
Доза излучения, квант*1019  

Рис 4. Дозовые зависимости интенсивности флуоресценции БСА в растворе. По оси абсцисс- доза излучения* 1019, по оси ординат - ln (Jфлобл¤Jфл0), Jфлобл - интенсивность флуоресценции раствора триптофана, облученный в разное время, Jфл0- интенсивность флуоресценции раствора триптофана необлученного.

 

Квантовый выход для БСА j=0,11%

 

В ходе лабораторной работы познакомились с методом флуориметрии. После обработки экспериментальных дынных можно сделать следующие выводы:

1. При концентрации триптофана в пробе от 0-0,3 мг/мл зависимость Jф=f(c) сохраняет относительную линейность.

2. При концентрации БСА в пробе от 0 мг/мл- 0,04 мг/млзависимость Jф=f(c) сохраняет относительную линейность.

3. Квантовый выход свободного триптофана в водном растворе равен 0,083% и квантовый выход триптофановых остатков в составе молекул сывороточного альбумина равен 0,11%.

4. Квантовые выходы БСА и триптофана различаются потому, что чет я хз че написать, точнее я понимаю почему но красивые фразы чет в голову не лезут… если че завтра придумаем.

 

 

Отчет по лабораторной работе №6

По дисциплине «Информационные системы управления предприятием»

Тема: «Ознакомление с генератором отчетов QuickViewer»




<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Москва 2012 | 

Дата добавления: 2015-06-15; просмотров: 651. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Практические расчеты на срез и смятие При изучении темы обратите внимание на основные расчетные предпосылки и условности расчета...

Функция спроса населения на данный товар Функция спроса населения на данный товар: Qd=7-Р. Функция предложения: Qs= -5+2Р,где...

Аальтернативная стоимость. Кривая производственных возможностей В экономике Буридании есть 100 ед. труда с производительностью 4 м ткани или 2 кг мяса...

Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ МОЗГА ПОЗВОНОЧНЫХ Ихтиопсидный тип мозга характерен для низших позвоночных - рыб и амфибий...

Принципы, критерии и методы оценки и аттестации персонала   Аттестация персонала является одной их важнейших функций управления персоналом...

Пункты решения командира взвода на организацию боя. уяснение полученной задачи; оценка обстановки; принятие решения; проведение рекогносцировки; отдача боевого приказа; организация взаимодействия...

Билет №7 (1 вопрос) Язык как средство общения и форма существования национальной культуры. Русский литературный язык как нормированная и обработанная форма общенародного языка Важнейшая функция языка - коммуникативная функция, т.е. функция общения Язык представлен в двух своих разновидностях...

Патристика и схоластика как этап в средневековой философии Основной задачей теологии является толкование Священного писания, доказательство существования Бога и формулировка догматов Церкви...

Основные симптомы при заболеваниях органов кровообращения При болезнях органов кровообращения больные могут предъявлять различные жалобы: боли в области сердца и за грудиной, одышка, сердцебиение, перебои в сердце, удушье, отеки, цианоз головная боль, увеличение печени, слабость...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.011 сек.) русская версия | украинская версия