Студопедия — ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ






Материал исследования

Дрозофила является адекватной моделью для изучения взаимосвязи сигнальных систем, запускаемых GDNF, и систем стрессорного ответа БТШ, ответственных за наличие в мозге тех или иных белковых отложений являющихся характерной чертой НДЗ различной этиологии. Использование животных моделей для понимания процессов нейродегенерации обусловливается тем, что практически невозможно получать образцы тканей на ранних стадиях НДЗ. Использование дрозофилы в качестве модели позволяет изучать механизмы функциональных нарушений на ранних стадиях и на различных образцах тканей. Кроме того, дрозофила имеет короткий жизненный цикл, и ее содержание относительно недорого. Поэтому в качестве материала исследования использовали следующие линии D. melanogaster:

Canton-S – линия дикого типа из США;

Berlin – линия дикого типа, выделена из природной популяции города Берлина. Широко используется при анализе поведения в Европе;

Oregon-R – линия дикого типа из природной популяции штата Орегон, США. На генетическом фоне этой линии дикого типа существуют многие известные линии-маркеры и балансеры;

agnts3 – мутантная линия, дефектная по синтезу LIMK1, ключевого фермента ремоделирования актина.

Воздействие тепловым шоком

Мух содержали при +25°С на стандартной изюмно-дрожжевой среде при свето-темновом цикле 12: 12. Тепловое воздействие на личинок D. melanogaster проводили в водяной бане GFL 1086 (GFL, Германия) при температуре +37°C в течение 30 минут. Воздействие проводили на стадии личинок III возраста. В каждом варианте эксперимента было использовано не менее шестнадцати особей. Фиксация происходила через 1 час после ТШ. В качестве контроля использовали интактных животных (без ТШ).

Иммунофлюоресцентный анализ распределения БТШ70

Исследование было проведено в Центре коллективного пользования «Конфокальная микроскопия» Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Препараты анализировали при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss (иммерсионный объектив 63x).

Методика whole mount иммунофлюоресцентного окрашивания органов дрозофилы для конфокальной микроскопии позволила нам проследить локализацию БТШ70 в нервно-мышечных синапсах личинок данных линий.

Приготовление нейромышечных препаратов осуществляли на стадии личинок III возраста. Выделение контактов проводили в фосфатном буфере (PBS) на льду. Фиксировали в 4 % растворе параформальдегида в PBS в течение 20 мин. Отмывали фиксатор в РВS 3 раза по 1 минуте и 3 раза по 5 минут. Отмывали в PBT (PBS, 0.2% Tween 20, 0,2% Triton X-100) 3 раза по 1 минуте и три раза по 5 минут.

Инкубировали в 10 % блокировочной сыворотке (Normal donkey serum, Santa Cruz Biotechnology, USA) в PBT (pH = 7,5) в течение 1 часа при комнатной температуре.

В работе использовали первичные антитела (AT I) antibody 5A5 Mouse monoclonal to heat shock protein 70 (HSP70) (Abcam) и вторичные антитела (AT II) Atto 647 donkey anti-mouse (НПО "Биотехнологии") и флюоресцентные красители: FITC–конъюгированные anti-HRP–FITC–conjugated (Jackson Immuno Research) и DAPI (Carl Roth).

Инкубировали с AT I (разведение 1: 100) в 10 % блокировочной сыворотке, приготовленной на PBT, в течение суток при +40С. Для лучшей проницаемости AT I в инкубационный раствор добавляли 1 % раствор DMSO. Препараты вынимали из холодильника и прогревали до комнатной температуры 1 час. Отмывали AT I в растворе PBT 3 раза по 1 минуте и 4 раза по 20 минут.

Инкубировали с AT II (разведение 1: 100) в 10 % блокировочной сыворотке, приготовленной на PBT, в течение 4 часов в темноте при комнатной температуре. Удаляли AT II и промывали в PBT 3 раза по 1 минуте и 4 раза по 10 минут. Отмывали в РBS 3 раза по 1 минуте и 2 раза по 15 минут.

Окраска ядер раствором DAPI (Roth, Германия) в PBS (рН = 7,5) осуществлялась в течение 40 минут при комнатной температуре. Использовали маточный раствор 100 мкМ, состоящий из 350 мкг DAPI в миллилитре дистиллированной воды. Рабочий раствор: 6,7 мкл маточного раствора DAPI и 1,9 мл PBS. Отмывали в PBS 3 раза по 1 минуте и 2 раза по 5 минут.

Заключали в 50 %-ный раствор глицерина на фосфатном буфере.







Дата добавления: 2015-08-30; просмотров: 452. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Практические расчеты на срез и смятие При изучении темы обратите внимание на основные расчетные предпосылки и условности расчета...

Функция спроса населения на данный товар Функция спроса населения на данный товар: Qd=7-Р. Функция предложения: Qs= -5+2Р,где...

Аальтернативная стоимость. Кривая производственных возможностей В экономике Буридании есть 100 ед. труда с производительностью 4 м ткани или 2 кг мяса...

Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...

Гальванического элемента При контакте двух любых фаз на границе их раздела возникает двойной электрический слой (ДЭС), состоящий из равных по величине, но противоположных по знаку электрических зарядов...

Сущность, виды и функции маркетинга персонала Перснал-маркетинг является новым понятием. В мировой практике маркетинга и управления персоналом он выделился в отдельное направление лишь в начале 90-х гг.XX века...

Разработка товарной и ценовой стратегии фирмы на российском рынке хлебопродуктов В начале 1994 г. английская фирма МОНО совместно с бельгийской ПЮРАТОС приняла решение о начале совместного проекта на российском рынке. Эти фирмы ведут деятельность в сопредельных сферах производства хлебопродуктов. МОНО – крупнейший в Великобритании...

Вопрос 1. Коллективные средства защиты: вентиляция, освещение, защита от шума и вибрации Коллективные средства защиты: вентиляция, освещение, защита от шума и вибрации К коллективным средствам защиты относятся: вентиляция, отопление, освещение, защита от шума и вибрации...

Задержки и неисправности пистолета Макарова 1.Что может произойти при стрельбе из пистолета, если загрязнятся пазы на рамке...

Вопрос. Отличие деятельности человека от поведения животных главные отличия деятельности человека от активности животных сводятся к следующему: 1...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.009 сек.) русская версия | украинская версия