Иммобилизованных лекарственными препаратами
3.2.1 Синтез и исследование наночастиц сывороточного альбумина, иммобилизованных противоопухолевым препаратом «Арглабин» Одним из перспективных биополимеров для получения наночастиц является сывороточный альбумин, используемый в качестве полимерных носителей лекарственных препаратов. Сывороточный альбумин используется в медицине при лечении шока, ожогов, гипоальбуминемии, после хирургических 88
травм, артрита и др. [98, c.177]. В работах [15, c.7; 98, c.180; 103, c.462] показано, что альбумин аккумулируется в зараженных тканях, а наночастицы, полученные на основе альбумина нетоксичны и хорошо переносятся человеческим организмом. Альбумин – огромная молекула белка, содержащая в своей структуре 585 аминокислотных остатков, связанных между собой 17 дисульфидными мостиками, он является одним из наиболее изученных белков организма. В настоящее определена аминокислотная последовательность в молекуле альбумина и охарактеризована ее пространственная структура. В молекуле альбумина имеется большое количество реакционноспособных участков, благодаря которым он связывает низкомолекулярные вещества, в том числе, лекарственные средства преимущественно слабокислого и нейтрального характера. Наличие в структуре альбумина множества реакционноспособных центров (тиоловые, имидазольные, карбоксильные и аминогруппы) дает возможность связывания его молекул бифункциональным соединением – глутаровым альдегидом. В частности, возможно сшивание по аминным связям с образованием иминов. Кроме того, функциональные группы (карбоксильные и аминные), присутствующие в структуре альбумина позволяют модифицировать поверхность наночастиц, прикрепляя «узнающие» (направляющие) молекулы [101, c.130; 109, c.4795]. Благодаря своей функции транспортировать низкомолекулярные вещества, в том числе, различные лекарственные препараты, поступающие извне, альбумин является уникальным переносчиком лекарств в органы-мишени, связываясь с которыми пролонгирует их действие. Связывание с альбумином обеспечило пролонгированный эффект таких препаратов белкового происхождения, как «Альбуферон» и «Левемир» [98, c.180]. Совместно с научной группой Института фармацевтической технологии Университета имени Й.Гете под руководством профессора Й.Кройтера нами исследована возможность иммобилизации сывороточного альбумина противоопухолевым препаратом «Арглабин», при этом использовались обе формы лекарственного препарата – нативная (субстанция) и гидрохлорид диметиламиноарлабина. Ранее в лаборатории физико-химии полимеров КарГУ им. Е.А. Букетова получены иммобилизованные Арглабином наночастицы на основе гомо- и сополимеров метилметакрилата, акриловой и метакриловой кислот, β- винилоксиэтиламида акриловой кислоты и др. [52, c.55; 53, c.240]. Новая лекарственная форма получена методом эмульсионной полимеризации, который позволил создать частицы размерами от 200 нм до 1000 нм с максимальной степенью связывания 68 %. Показано, что противоопухолевый эффект наночастиц, иммобилизованных лекарственным веществом увеличивался по сравнению с раствором Арглабина гидрохлорида [52, c.55; 53, c.240]. Результаты медико-биологических испытаний показали, что индивидуальные полимеры не обладают противоопухолевой активностью, однако при включении Арглабина в состав этих полимеров наблюдался относительно высокий противоопухолевый эффект в отношении клеток
карциномы Н157 и меланомы НТ144 [53, c.240]. Однако биосовместимость большинства испытанных полимеров мало изучена, поэтому в продолжение этих работ нами в настоящей главе рассмотрена возможность связывания противоопухолевого препарата Арглабин сывороточным альбумином. В работах [115, c.197; 116, c.171; 117, c.209] наночастицы сывороточного альбумина получали методами эмульсионной полимеризации, десольвации и коацервации. Одним из наиболее простых и эффективных методов является получение наночастиц в обратной эмульсии [115, c.197; 116, c.171; 117, c.209]. Однако этот метод имеет некоторые недостатки, ограничивающие его применение, одним из которых является необходимость удаления остатков эмульгатора, стабилизатора и других органических компонентов после проведения процесса [117, c.209]. Kreuter J., Langer K. с коллегами (университет имени Й. Гете) [115, c.197; 116, c.171; 117, c.209] в качестве альтернативы для синтеза наночастиц сывороточного альбумина предложили метод десольвации, суть которого заключается в следующем: растворенный в воде сывороточный альбумин подвергают десольвации этанолом с последующей стабилизацией частиц, затем макромолекулы альбумина сшивают глутаровым альдегидом. Используя разработанную немецкими учеными [115, c.197] методику получения наночастиц альбумина десольвацией в настоящем исследовании также были получены наночастицы сывороточного альбумина [151]. В результате исследований найдено, что оптимальная скорость подачи десольватирующего агента (этанола) в среду составляет 1 мл/мин, а значение рН 8,2-8,5 является оптимальным для получения наночастиц без агрегации, что сопоставимо с результатами, полученными в работах [115, c.197; 116, c.171; 117, c.209]. Скорость подачи десольватирующего агента (этанола) регулировали с помощью мининасоса и поддерживали постоянной. От не прореагировавшего сывороточного альбумина раствор очищали трехкратной промывкой водой и последующим центрифугированием. Выход полученных десольвацией наночастиц составил 39,2 - 40,4 масс. % (по гравиметрическому методу). О физико-химических характеристиках наночастиц судили по следующим параметрам: размер частиц (d, нм), полидисперсность (Р), ζ-потенциал (мВ). Результаты двух независимо полученных образцов сведены в таблицу 12.
Таблица 12 - Физико-химические характеристики наночастиц сывороточного альбумина
90
Данные о наночастицах, полученные фотонной корреляционной спектроскопией, указывают на то, что проба 1 из образца А значительно откланяется по размеру частиц от других проб. Измерения размера частиц и полидисперстности, сделанные методом фотонной корреляционной спектроскопии показали наличие в этой пробе двух групп частиц, с размерами от 100 до 400 нм, и группа частиц с размером более 500 нм (рисунок 30а).
(а)
(б)
(в)
Рисунок 30 – Дифференциальные кривые распределения объема и массы частиц сывороточного альбумина по их размерам
При этом, доля частиц с размерами более 500 нм составляет менее 10%. Средний диаметр частиц составил 222,9 нм, с полидисперстностью 0,154. При получении полимерных наночастиц важным является также изучение агрегативной и седиментационной устойчивости системы, что определяется 91
поверхностным зарядом частиц [121, c.196]. Поверхностный заряд частиц количественно характеризуется ζ-потенциалом и определяет возможность и скорость перемещения дисперсной фазы относительно дисперсионной среды, устойчивость дисперсных систем и разрушение их электролитами [121, c.196]. Близкое к нейтральному значение ζ-потенциала (-11,3мВ) в данном случае указывает на коагуляционное происхождение второй группы частиц (таблица 12). Коагуляция наночастиц могла произойти во время их очистки. Несмотря на то, что эта проба была исключена из дальнейших исследований, нам показалось интересным проследить за изменениями параметров этой системы при обработке ультразвуком. С этой целью пробу 1 погружали в ванну, где подвергали УЗ-излучению. После первых 5 минут обработки диаметр частиц незначительно уменьшился, а величина полидисперстности осталась практически на прежнем уровне (d=212,4 нм, Р=0,153). Это состояние системы можно наблюдать на рисунке 36 б, из которого видно бимодальное распределение частиц по размеру. Обработка образца УЗ в течение 10 минут позволила снизить средний размер частиц до 200,7 нм, при этом уменьшилась и степень полидисперстности (Р=0,141), что соответствует мономодальной кривой распределения частиц (рисунок 30 в). Наиболее перспективным, для дальнейших исследований в качестве полимерных носителей, из полученных нами образцов является образец В, поскольку имеет меньший диаметр частиц (158,6-159,2 нм) и низкое значение полидисперсности (0,018-0,022). Следует также отметить, что испытуемые образцы имеют низкое отрицательное значение среднего заряда поверхности частиц (таблица 12), при этом наночастицы альбумина в образцах пробы В характеризуются наименьшим значением ζ;-потенциала (рисунок 31), что указывает на достаточную стабильность коллоидной системы во времени.
Result Zeta Potential (mV): StDev(mV): Conductivity (mS/cm): -31.2 6.5 0.00 Mobility (umcm/V.s): StDev (umcm/V.s): F(ka): -2.447 0.508 1.50 Рисунок 31 - Распределение электрического заряда на поверхности раздела наночастиц сывороточного альбумина
92
Электронно-микроскопические снимки полученных образцов свидетельствуют о сферической форме наночастиц, узком распределении по размеру и практически отсутствии агрегации частиц (рисунок 32). Снимки иллюстрируют, что размеры частиц находятся в пределах 80-150 нм.
Рисунок 32 - Электронно-микроскопические снимки частиц пустых наночаситц сывороточного альбумина
Таким образом, нами получены наночастицы сывороточного альбумина с удовлетворительными физико-химическими характеристиками, что позволяет их использовать в качестве носителей лекарственных препаратов. В настоящее время известны два способа иммобилизации лекарственных веществ в полимерные наноносители [117, c.210]: адсорбция лекарственного вещества (ЛВ) на поверхности предварительно полученных наночастиц и включение лекарства в полимерную матрицу в процессе синтеза частиц. В настоящем исследовании испытаны оба пути иммобилизации Арглабина в систему частиц: адсорбция лекарственного вещества на заранее полученных наночастицах альбумина и включение Арглабина в полимерную матрицу наночастиц с применением описанного выше метода десольвации. Известно [117, c.210], что адсорбция лекарственного вещества на заранее полученных системах носителей порождает риск потери лекарства в процессе десорбции. Для предотвращения инактивации лекарства при хранении и ранней деградации комплекса полимер-лекарство после инъекции нами исследовалась адсорбция на наночастицы не гидрофильной формы противоопухолевого препарата (гидрохлорида диметиламиноарглабина), а его нативной формы т.е. нерастворимого в воде гидрофобного Арглабина (субстанции), далее Арглабина. Такой состав комплекса позволяет надеяться на отсутствие указанных выше недостатков из-за меньшей склонности нативного Арглабина десорбироваться из полимерных матриц в водную среду. С целью оптимизации включения ЛВ в наночастицы полученные из сывороточного альбумина и установления стандартного протокола их получения концентрацию Арглабина (субстанции) в сорбционном растворе варьировали в пределах 0,39-6,2 моль/л, при этом концентрацию альбумина во всех растворах поддерживали одинаковой, равной 5,9 мг/мл. Приготовили
93
растворы лекарства в этаноле объемами (от 0,05 до 0,8 мл), затем эти растворы добавляли в растворы пустых наночастиц альбумина, полученных описанным выше способом. Объем раствора в каждой пробе доводили этанолом до 2,21 мл. Процесс адсорбции включал 2-х часовое инкубирование Арглабина в дисперсный раствор наночастиц сывороточного альбумина при комнатной температуре (650 об/мин). После этого частицы отделяли центрифугированием и промывали водой. Оставшиеся после каждой промывки растворы собирали и предварительно разделив растворы Арглабина и сывороточного альбумина методом колоночной хромотографии (на колонке Sephadex фирмы Sigma Chemical Co. DE-52) анализировали на содержание в растворе свободного лекарства спектрофотометрически (λ=204 нм). Результаты по степени связывания Арглабина с наночастицами сывороточного альбумина, полученные на спектрофотометре U3000 Spectrophotometer (Hitachi), представлены ниже на рисунке 33.
0,39 0,78 1,16 1,55 3,10 6,20 -6
Рисунок 33 - Адсорбционное присоединение Арглабина на наночастицах сывороточного альбумина
Как видно из диаграммы при низких концентрациях Арглабина более 80% лекарства может сорбироваться на поверхности наночастиц (рисунок 33). С увеличением концентрации лекарственного вещества в исходном растворе, доля адсорбируемого Арглабина увеличивается, доходя почти до 98 %, что доказывает минимальную возможность десорбции нерастворимой в воде нативной формы Арглабина после адсорбции. Экспериментальные данные о физико-химических характеристиках наночастиц сывороточного альбумина, адсорбировавших нативный Арглабин приведены в таблице 13. Из таблицы 13 видно, что распределение частиц по размерам находится в относительно узком интервале значений, при этом система достаточно стабильна. Как и ожидалось, ввиду электронейтральности нативного Арглабина абсолютное значение ζ-потенциала остается достаточно низким (от -11,0 до - 23,0 мВ), что обеспечивает подвижность наночастиц и предотвращает их
94
коагуляцию, соответственно размеры частиц изменились незначительно (160,8±2).
Таблица 13
-
Характеристики наночастиц сывороточного
альбумина, иммобилизованных методом адсорбции Арглабином (субстанция)
Полученная изотерма адсорбции была проанализирована с применением эмпирического уравнения Фрейндлиха, которое показало высокую степень корреляции (R^0,97) и возможность дальнейшего нагружения наночастиц альбумина Арглабином (рисунок 34).
95
y = 2,0648x + 0,9128
|
