Результати визначення цукру й цукрози калориметричним методом
Завдання 3 Визначення активності ферменту орто-дифенолоксидази фотоколориметричним методом
В живих клітинах свіжих плодів, овочів і картоплі фермент орто-дифенолоксидаза у присутності вільного кисню каталізує окислення поліфенолів, монофенолів і орто-дифенолів з утворенням окислених речовин – хінонів, які, конденсуючись, перетворюються на темнозабарвлені з'єднання - флобафени. У місцях ударів і механічних пошкоджень м'якоть продукції темнішає, що знижує її товарну якість, можливість збереження й підвищує кількість відходів при переробці. У клітинах здорових тканин система перетворення поліфенолів у хінони і навпаки є проміжною ланкою при окисленні органічних з'єднань в процесі дихання рослин. Вимірювання активності ферменту ортодифенолоксидази засноване на швидкості окислення ним розчину парафенілендіаміну або диметил-п-фенілендіаміну з утворенням з'єднання, забарвленого в помаранчево-червоний колір. Інтенсивність забарвлення розчину визначають на фотоелектроколориметрі. Прилади: фотоелектроколориметр ФЕК-56-М чи КФК-3; аналітичні терези; центрифуга; секундомір. Обладнання Піпетки на 2 мл чи дозатори піпеточні на 1000-2000 мкл, мірні колби на 25мл чи 50 мл; порцелянова ступка, скляна воронка; скляний порошок, хімічні склянки на 1000, 200, 10 мл. Реактиви. 1%-ний розчин пірокатехіну, виготовлений на 0,01 н. розчині щавлевої кислоти; 0,01—0,02 % розчин парафенилендіаміну, виготовлений на 0,01 н. розчині щавлевої кислоти; фосфатний буфер рН 7,0—7,4 Дослідні матеріали яблука, клубні картоплі, огірки, тощо. Хід виконання роботи 1.Приготування розгинів та реактивів а) Готують 0,01 н розчин щавлевої кислоти (кислоту додають у воду). б) 1%-ный розчин пірокатехіну. У ємкість з 99 мл 0,01 н. розчином щавлевої кислоти додають 1 мл пірокатехіну; в) 0,01—0,02 %- розчин парафенілендіаміну. У ємкість з 99 мл 0,01 н. розчином щавлевої кислоти додають 1-2 мл парафенілендіаміну; г) фосфатний буфер рН 7,0—7,4. Вносять в хімічну мірну склянку на 200 мл 81 мл 0,2 М Na2НРО4 2Н2О, додають 19 мл 0,2 М NaН2РО4 Н2О та доливають дистильованої води до 200 мл. 2.Порядок проведення аналізу На годинниковому склі зважити 0,5—1,0 г рослинного матеріалу (яблука, клубні картоплі й т. п.). Наважку перенести у порцелянову ступку, додати в неї кілька кристалів скляного піску, прилити 4—5 мл фосфатного буферу й розтерти до однорідної маси. Вміст ступки (без втрат) перенести через воронку в мірну колбу місткістю 25 чи 50 мл. Ступку й товкачик обмити невеликою кількістю буферу, який також злити у мірну колбу. Вміст колби довести буфером до мірки й ретельно перемішати. Визначення активності ферменту проводять безпосередньо у суміші або після її центрифугування чи фільтрування. В дві кварцові кювети, завтовшки 2 см прилити окремими піпетками в кожну спочатку по 2 мл витяжки (фільтрату), потім по 2 мл дистильованої води й по 2 мл розчину парафенілендиаміну. Кювети поставить у ФЕК -56-М і обертанням лівого барабана встановити стрілку гальванометра на нульову точку при відкритому помаранчевому або червоному світлофільтрі. Потім правим барабаном відвести стрілку гальванометру в праве положення (Е = 0,125 або 0,250). У контрольну кювету (ліворуч) підлити 2 мл 0,01 н. розчину щавлевої кислоти, а в дослідну (праворуч) – 2 мл розчину пірокатехіну в 0,01 н. щавлевій кислоті. З внесенням першої краплі розчину пірокатехіну включають секундомір. Через протікання ферментативної реакції рідина в дослідній кюветі набирає забарвлення. Стрілка гальванометра починає рухатися від краю шкали до нульової позначки із швидкістю, яка залежить від активності ферменту у витяжці. В той момент, коли стрілка досягне нульової позначки, секундомір зупиняють. При визначенні активності ферменту орто-діфенолоксидації з допомогою сучасного фотоєлектрокалориметру з електронним програмуванням, наприклад КФК-3, значення екстинції автоматично висвітлюється на шкалі приладу.
Активність ферменту (А) у відносних одиницях на 1 г речовини обчислюють за формулою
де Е –екстинкція (Е = 0,125 чи 0,250); а – об’єм витяжки, мл (а = 25 чи 50); в – ступінь розведення витяжки (в = 4); с – товщина рідини в кювете, см (с = 2);); t – час, с; m – наважка продукту, г.
Оформити результати дослідження. Отримані результати дослідження заносять до таблиці, відповідно до наведеної таблиці 6.3.,й порівнюють між собою. Роблять висновок про якість продукту.
Таблиця 6.3. Результати визначення активності ферменту орто-дифенолоксидази фотоколориметричним методом
Завдання 4 Визначення активності ферменту пероксидази Пероксидаза виконує велику роль в процесі дихання рослин. Субстратом цього ферменту є поліфеноли у вільному стані або у формі різноманітних з'єднань (глікозидів, дубильних речовин) і ароматичні аміни. Окислення цих речовин фермент здійснює за допомогою перекису водню або яких-небудь органічних перекисів, в тому числі перекисів ненасичених жирних кислот і каротину. Крім того, пероксидаза деяких рослин, зокрема хрону, є одним із основних реагентів в сучасних імунофлюоресцентних методах дослідження в товарознавстві продовольчих товарів та суміжних з ними галузей науки при необхідності візначення молекулярних складових речовин, білків, їх динамічних змін, або присутності патогенних мікроорганізмів. Прилади. Фотоелектроколориметр ФЕК-56-М чи КФК-3; аналітичні терези; центрифуга; секундомір. Обладнання. Піпетки на 2 мл або дозатори піпеточні на 1000-2000 мкл, мірні колби на 25 або 50 мл; порцелянова ступка скляна воронка з тонким стеблом; скляний порошок, хімічні склянки на 1000, 200, 10 мл, скляні палички оплавлені з одного кінця. Реактиви. Ацетатний буфер з рН 4,7; розчин бензидину на ацетатному буфері; Дослідні матеріали яблука, клубні картоплі, огірки, тощо. Хід виконання роботи 1.Приготування розчинів та реактивів а) Ацетатний буфер з рН 4,7. У хімічний стаканчик внести 54 мл 0,2 М розчину ацетату натрію СНзСООNа ЗН2О й 46 мл 0,2 М розчину оцтової кислоти й ретельно перемішати скляною паличкою. б) Розчин бензидину на ацетатному буфері. У мірну колбу місткістю 200 мл внести 100 мл дистильованої води і 2,3 мл крижаної оцтової кислоти. Перемішати. Після перемішування до суміші додати 184 міліграм бензидину. Колбу нагрівати на водяній бані при 60 °С, постійно збовтуючи вміст для розчинення бензидину. Після повного його розчинення в колбу внести 5,45 г оцтовокислого натрію. Розчинити оцтовокислий натрій. Вміст колби охолодити і довести дистильованою водою до мітки. в) 3%-ний розчин перекису водню. У мірну хімічну склянку, місткістю 100 мл внести 96 мл дистильованої води, додати 3 мл перекису водню й ретельно перемішати. 2.Порядок проведення аналізу Наважку рослинного матеріалу масою 0,2—0,5 г тонко розтерти у порцеляновій ступці з 4 – 5 мл ацетатного буфера з рН 4,7. Перенести (без втрат) в мірну колбу місткістю 25 або 50 мл. Вміст колби довести ацетатним буфером до мітки і ретельно перемішати. Витримати розчин при кімнатній температурі 10 хв. Після цього витяжку центрифугувати 10 хв. при 3000 обертах/хв. Відібрати піпеткою надосадокову рідину для визначення активності ферменту. Рекомендується брати таке розведення наважки продукту, щоб зміна забарвлення рідини в дослідній кюветі відбувалася за 20—50 с. У дві кварцові кювети завтовшки 2 см внести по 2 мл ферментного розчину, 2 мл розчину бензидину і по 2 мл ацетатного буферу. Визначення здійснювати на ФЕКу при червоному світлофільтрі в тому ж порядку, як і при визначенні ферменту орто-дифенілоксидази. Спочатку стрілку гальванометру при відкритому світлофільтрі встановити на нульову точку, потім правим барабаном відвести стрілку гальванометру в праве крайнє положення так, щоб екстинкція була рівна 0,125 або 0,250. У ліву (контрольну) кювету внести піпеткою 2 мл води. У праву (дослідну) – кіювету внести піпеткою з широким 2 мл 3% розчину перекису водню. З внесенням першої краплі перекису водню включити секундомір. Розчин в дослідній кюветі набирає блакитне забарвлення. Стрілка гальванометра починає рухатися до нульової точки з швидкістю, яка залежить від активності ферменту. У момент досягнення стрілкою нульової поділки секундомір виключають й визначають час протікання реакції в секундах. Активність ферменту розраховують за тією ж формулою, що й для розрахунку активності ферменту орто-дифенілксидази.
Завдання 5. Ознайомитись з методами визначення кількості білка з допомогою спектрофотометра В ході досліджень постійно виникає необхідність визначати наявність та концентрацію білка в продуктах, сумішах а також при вивченні впливу розроблених продуктів на організм споживачів Визначення кількості білка в УФ-променях засноване на поглинанні світла присутніми в білці амінокислотами: триптофаном, тирозином й, у меншій мірі, фенілаланіном. Максимум поглинання триптофану в УФ-ділянці спектру – при 257 нм, а тирозину – при 294 нм. Вимірювання звичайно проводять при 280 нм. Оскільки вміст триптофану й тирозину в білках сильно варіює, коефіцієнт поглинання, виражений як Е, також значно варіює. В більшості індивідуальних білків величина Е лежить в інтервалі 0,4 – 1,5, але існують білки з коефіцієнтами поглинання рівними 0 (наприклад, Са+2-зв’язуючі білки). Коефіцієнти поглинання деяких імунохімічно значущих білків, які використовуються в сучасних іммунобіологічних методах дослідження в товарознавстві продовольчих товарів, наведені в таблиці 6.4. Як правило, для визначення оптичної щільності розчинів застосовують однопроменеві неавтоматичні спектрофотометри, призначені для вимірювання коефіцієнта пропускання або оптичної щільності рідких, твердих прозорих чи газоподібних речовин в ультрафіолетовій, видимій та близькій до інфрачервоної ділянках спектру. Принцип дії спектрофотометра заснований на тому, що монохроматичне світло з довжиною хвилі λ1 спочатку пропускають через розчинник, оптичну щільність якого приймають рівною нулю, а пропускання – 100 %, а потім – через розчин дослідного зразка. Для роботи у видимій і близькій до інфрачервоної областях спектру (визначення білка по Лоурі) існує лампа накалювання яка випромінює в області довжин хвиль 320 – 1100 нм. Джерелом ультрафіолетового світла слугує газорозрядна дейтерієва лампа, що генерує світло з довжинами хвиль 186 – 350 нм. У приладі використовується два фотоелементи: сурьмяно-цезієвий (Ф) – область спектру 186—650 нм і киснево-цезієвий (К) – 600 – 1100 нм. Відношення сигналу, який реєструється фотоелементом від світлового потоку I, що пройшов через зразок, до сигналу світлового потоку Іо, пропущеного через розчинник, визначають за шкалою відліку потенціометра у відсотках пропускання Тλ = І/Іо100 % або як оптичну густину А λ = lg 1/Т λ,. У кількісних вимірюваннях сліду враховувати, те, що при великій (>0,7) та малій (<0,2) оптичній щільності (А λ) точність істотно зменшується. Усунути цей недолік можна, підібравши таке розведення розчинів або товщину кювети, щоб покажчики шкали не виходили за межі 0,2–0,7. До найбільш широко вживаних методів визначення білка відносяться біуретовая реакція, метод Лоурі, вимірювання оптичної щільності розчинів в ультрафіолетовому світлі, зв’язування фарбників. Характеристика методів визначення білка наведена в таблиці 6.5.
Таблиця 6.4. Коефіцієнти екстинції деяких імунохімічно значущих білків для практичної та науково-дослідної роботи в товарознавстві продовольчих товарів і суміжних з ним галузях наук.
Таблиця 6.5. Характеристика методів визначення білка
Біуретовая реакція. Метод заснований на здатності лужного розчину солі міді утворювати мідь-білковий комплекс пурпурного кольору з пептидними ланцюгами білків (але не з бічними групами амінокислотних залишків). Інтенсивність цього забарвлення прямо пропорційна концентрації білка в розчині і її можна визначити спектрофотометрично при 540 або 310 нм. Метод вирізняється високою відтворюваністю, проте його чутливість низька. Крім того, для отримання тонких даних необхідні декілька міліграм зразка. Метод непридатний для визначення білка у фракціях, висолених сульфатом амонію(таблиця 6.5.). Метод Лоурі. В основі визначення концентрації білка методом Лоурі лежить реакція відновлення реактиву Лоурі – Фоліна – Гіокалто (реактив Фоліна) комплексом, що утворюється при взаємодії білка з іонами міді в лужному розчині (біуретова реакція). В результаті реакції виникає темно-синє забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації білка в розчині, причому будь-який пептидний зв'язок білка змінює забарвлення зразка, хоча і різною мірою. При аналізі проб з концентрацією білка 5 – 25 мкг/мл спектр поглинання фарбника, що утворився по закінченню реакції, має максимум при 750 нм, а при аналізі проб з більшою масовою часткою білка – при 500 нм. Величина оптичної щільності при проміжних значеннях довжини хвилі (600 нм) складає приблизно 90 % величини, отриманої при 750 нм. Тому інтенсивність забарвлення можна вимірювати при відповідній довжині хвилі в діапазоні 600 – 750 нм. Метод Лоурі вирізняється високою точністю й чутливістю (таблиця 6.5.), широко використовується в повсякденній практиці. Поглинання в УФ області спектру. Визначення кількості білка в УФ- променях базується на поглинанні світла амінокислотами, які присутні в білках Максимум поглинання триптофану в УФ- області спектр – при 257 нм, а тирозина – при 294 нм. Виміри звичайно проводять при 280 нм. Не дивлячись на те, що метод не має високої чутливості й точності, його успішно застосовують для швидкого визначення білка в хроматографічних елюатах, побудови профілів елююваного зразка з колонки. Метод придатний для визначення кількості білка в розчині за калібрувальною кривою, проте внаслідок неоднакового вмісту триптофану і тирозину в різних білках отримані результати можуть виявитися невірогідними (виключення складають визначення, в яких для побудови калібрувальної кривої взяті аналогічні зразки чистих білків). Перевагою метода є можливість використовувати в наступних аналізах зразки, в яких визначали білок. Метод зв’язування барвників. Суть методу полягає в тому, що деякі барвник при зв’язуванні з білком дають специфічне забарвлення, інтенсивність якого залежить від концентрації білка і може бути визначена спектрофотометрично або іншими способами. Найчастіше використовують барвник кумассі С-250, який у надхлорній кислоті забарвлює розчин в червоно–брунатний колір, а при зв’язуванні з білком за тих же умов – в синій. Інтенсивність забарвлення визначають при 595 нм. Цей метод більш чутливіштй та простіший й не менше точний, ніж метод Лоурі (таблиця 6.5.). До його недоліків можна віднести тільки те, що адсорбований на стінках кювети барвник потрібно відмивати перед кожним вимірюванням розчином додецилсульфату натрію (ПДВ). Завдання 6. Побудувати калібрувальну криву для визначення кількості білка за поглинанням в УФ –світлі при 280 нм Прилади. Спектрофотометр; аналітичні ваги, гомогенізатор. Обладнання. Мірні хімічні стакани на, 100, 10 мл, скляні палички оплавлені з одного кінця, піпетки; градуйовані на 5-10 мл; мірні пробірки, штатив для пробірок, фарфорова ступка з товкачиком. Реактиви. Бичачий сироватковий альбумін чи будь-який очищений білок; 0,15моль / л розчин хлориду натрію. Дослідні матеріали: м’ясо, сир, клубні картоплі, тощо. Хід виконання роботи 1.Підготувати спектрофотометр до роботи. Підготовка спектрофотометра до роботи в УФ-ділянці спектру й вимірювання оптичиної щільності виготовлених зразків білка при 280 нм. При підготовці спектрофотометра до роботи і виконанні вимірювань керуватися інструкцією, доданою до приладу 2.Порядок проведення аналізу а) Виготовлення зразків з відомою кількістю білка. Поставити в штатив дев'ять пробірок. У першу налити 10 мл розчину хлориду натрію, 0,15 міль/л, і внести 10 міліграм высокоочищенного контрольного білка, заздалегідь перевіривши його на розчинність. З другої по дев'яту пробірки налити по 5 мл хлориду натрію, 0,15 міль/л. Градуйованою піпеткою перенести 5 мл розчину білка з першої пробірки в другу, перемішати, потім помістити 5 мл отриманого зразка в наступну пробірку і так далі. У дев'яту пробірку (контроль) зразок не вносити. б) Підготувати дослідні зразки до вимірювання З допомогою гомогенізатора подрібнити шматочок (15-20 г) дослідного продукту. Перенести подрібнений матеріал у хімічну склянку. Залити 50 мл фізіологічного розчину. Витримати 10 хв. Розчин зібрати градуйованою піпеткою у чисту хімічну склянку. Профільтрувати з допомогою фільтрувального паперу. Виготовлений зразок підготувати до вимірювання на спектрофотометрі так як і зразок для побудови калібрувальної кривої. Провести вимірювання на спектрофотометрі. Побудувати графік (калібрувальну криву) у залежності від оптичної щільності (ось ординат) від кількості білка в зразках (ось абсцис). Визначити оптичну щільність досліджуваного продукту. Визначити кількість білка (мг/мл) в продукті, який досліджується з допомогою побудованої калібровальної кривої. Внести отримані значення в таблицю. Зробити висновок про якість продукту. Отримані результати дослідження занести до таблиці. Оформити результати дослідження за зразком таблиці 6.7. Таблиця 6.7.
Результати визначення визначення кількості білка за поглинанням в УФ –світлі при 280 нм
Завдання 7. Побудувати калібрувальну криву для визначення білка за методом Лоурі Прилади. Спектрофотометр; аналітичні ваги, рН-метр. Обладнання. Мірні хімічні склянки на, 1000, 100, 10 мл, скляні палички оплавлені з одного кінця, піпетки; градуйовані на 5-10 мл; мірні пробірки, порцелянова ступка з товкачиком; дві хімічні склянки на (50 мл), 25 пробірок (20–25 мл), градуйовані піпетки (1 и 5 мл), штатив для пробірок, марлеві серветки, фільтрувальний папір Реактиви. Розчин хлориду натрію (0,15 моль/л), дистильована вода, 10%-ні розчини НСl й NaОН, реактив Фоліна Дослідні матеріали: Високоочищений ліофілізований γ-глобулін, альбумін, чи який-небудь інший білок, що добре розчиняється в хлориді натрію. Хід виконання роботи 1.Приготування реактиву Фоліна Для визначення білка за методом Лоурі слід використовувати розчини з нейтральними значеннями рН. а) Реактив А. З’єднати у мірній хімічній склянці (1000 мл) з 20,0 г карбонату натрію (Nа2СОз) і 4,0 г гідроксиду натрію (Nа ОН). Довести до мітки 1000 мл дистильованої водою. б)Реактив Б. З’єднати у мірній хімічній склянці 0,5 г сульфату міді (СuSO4 5Н2О) й 1,0 г цитрату натрію (Nаз-цитрат). Довести дистильованою водою до 100 мл. в)Реактив С.Змішати 50 мл реактиву А й 1 мл реактиву Б; г)Реактив Е (реактив Фолина). В хімічну склянку, емністю 1000 мл, внести 100 г Nа2WO4 2Н2О и 25 г Nа2МоО4 2Н2О. Додати 700 мл дистильованої води й повністю розчинити сіль. Внести 50 мл 85 %-ного розчину НзРО4. Перемішати. Додати 100 мл концентрованої НСl. Суміш кип'ятити із зворотним холодильником протягом 10 годин, потім внести 150 г LiSO4, 50 мл дистильованої води й декілька крапель брому або бромистої води. Розчин кип'ятити без холодильника протягом 15 хв. для видалення надлишку брому. Охолодити, довести об'єм суміші до 1000 мл. Зберігати в темному місці, застосовувати в двократному розведенні. 2.Підготувати спектрофотометр до роботи. Підготовка спектрофотометра до роботи у видимій області спектра й спектрофотометрія підготовлених зразків здійснюється при 750 нм. При виконанні вимірів керуються інструкцією, що додається до приладу 3.Порядок проведення аналізу 1.Виготовлення зразків з відомою кількістю білка. Внести в пробірку 10 мл розчину хлориду натрію (0,15 міль/л) і 10 міліграм высокоочищенного контрольного білка й розмістити у штативі дванадцять пробірок, як наведено в таблиці 6.8 Таблиця 6.8. Визначення кількості білка за методом Лоурі
В перші десять пробірок внести від 0,1 до 1 мл розчину контрольного білка. Довести вміст всіх пробірок до 2 мл розчином хлориду натрію (0,15 міль/л). Додати в кожну пробірку по 5 мл реактиву С, перемішати й інкубувати при кімнатній температурі 10 в. Потім у всі пробірки внести по 0,5 мл реактиву Е, знову швидко перемішати і інкубувати при кімнатній температурі 30 в. Протягом цього часу реактив Воліна реагує з мідь-білковим комплексом, розвивається темно-синє забарвлення розчину, інтенсивність якого пропорційна масовій частці білка. Виміряти на спектрофотометрі значения А λ, залежно від концентрації білка. Отримані результаті дослідження занести до таблиці, за зразком таблиці 6.9.. Таблиця 6.9. Результати визначення білка за методом Лоурі
Побудувати графік залежності (калібрувальної кривої) А λ (вісь ординат) від кількості білка в зразку (вісь абсцис).
Контрольні питання
1. Принцип методів спектроскопії. 2. Групи товарів в оцінці якості яких використовують спектральні методи дослідження. 3. Характеристики продовольчих товарів які отримуються при використанні різних спектральних методів. 4. Одиниці вимірювання, які використовуються при спектральних методах дослідження. 5. Використання в товарознавстві продовольчих товарів колориметрії. 6. Використання в товарознавстві продовольчих товарів фотоколориметрії. 7. Використання в товарознавстві продовольчих товарів нефелометрії. 8. Порівняння напрямку використання та чутливості методів спектроскопії. 9.Які методи застосовують для визначення концентрації білка? Дайте характеристику кожному з них. 10. У чому суть принципу роботи спектрофотометра? 11. Як провести вимірювання й побудувати калібрувальні криві для визначення концентрації білка методом Лоурі за поглинанням в УФ-світлі при 280 нм?
|
