Занятие № 10Культура клеток – это клетки многоклеточных организмов (человека, животных), живущие и размножающиеся in vitro. Подразделяются на: Ø первичные (неперевиваемые); Ø полуперевиваемые; Ø перевиваемые. Первичные (неперевиваемые) культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов и тканей организма (почек, легких, кожи, тимуса, тестикул эмбриона человека или молодых животных). Этапы приготовления первичных культур клеток: Ø выделение органа/ткани; Ø измельчение и гомогенизация ткани до частиц размером 2-4 мм; Ø разъединение клеток путем трипсинизации; Ø внесение в пробирку (флакон, матрас) с питательной средой (среда 199, Игла); Ø инкубирование в термостате – клетки начинают делиться до покрытия поверхности стекла в один слой и прекращают размножаться (контактное торможение). Первичные культуры клеток живут ≈ 7-21 день, при пересевах меняют форму и гибнут. Полуперевиваемые культуры клеток – диплоидные клетки человека, выдерживающие до 50-100 пассажей (после перевивания в новую пробирку со свежей питательной средой вновь начинают размножаться до образования монослоя). Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время (злокачественные/опухолевые клетки с гаплоидным набором хромосом, выдерживающие бесконечное количество пассажей): например, HeLa – клетки рака шейки матки (получены от женщины, умершей в 1956 г.), Нep-2 – клетки карциномы гортани и др. Методы индикации вируса в культуре клеток: 1) цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клетки – дегенеративные морфологические изменения клеток (мелкозернистое перерождение, округление, фрагментация, образование симпластов); 2) образование вирусом специфических внутриклеточных включений; 3) бляшкообразование (феномен Дальбекко) – образование в монослое клеток «стерильных пятен» (бляшек – деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться красителем нейтральным красным (количество бляшек соответствует количеству вирусных частиц); 4) цветная проба Солка – сохранение первоначального цвета среды (красного) при наличии вируса, тогда как активные незараженные вирусом клетки метаболизируют и изменяют цвет среды (желтый); 5) РГА с культуральной жидкостью; 6) реакция гемадсорбции (РГадс) – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженной вирусом клетки; 7) феномен интерференции (используется для обнаружения вирусов, не оказывающих ЦПД и не вызывающих гемагглютинацию) – в зараженную материалом культуру клеток вносят индикаторный вирус (ВВС – вирус везикулярного стоматита) с известным ЦПД (симпластобразование) – при наличии в культуре клеток исследуемого вируса индикаторный вирус ЦПД не окажет (клетка может поражаться только одним вирусом). Достоинства – получение максимальной концентрации вируса. Недостатки – не все вирусы культивируются в культуре клеток.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ДЛЯ ОБУЧАЮЩИХСЯ по дисциплине «микробиология» для специальности 060301 – Фармация (очная форма обучения)
К ЛАБОРАТОРНОМУ ЗАНЯТИЮ № 10 Тема: «Методы культивирования вирусов. Бактериофаги» Утверждены на кафедральном заседании протокол № ____ от «___»____________ 20__ г.
Заведующая кафедрой микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича к.б.н., доц. ___________________Перьянова О.В.
Составители: к.б.н., доц. ___________________Перьянова О.В. ст. препод. ___________________Подгрушная Т.С.
Красноярск Занятие № 10 Тема: «Методы культивирования вирусов. Бактериофаги» 2. Форма организации занятия: лабораторное занятие 3. Значение изучения темы Лекарственно-устойчивые микроорганизмы возникли и стали развиваться после внедрения химиопрепаратов и антибиотиков в клиническую практику. Этот процесс наблюдается не только среди патогенных, но и условно- патогенных форм микроорганизмов. Последние часто становятся причиной осложнения, вплоть до тяжелых форм гнойно-септических заболеваний. Поэтому весьма актуально использование уже имеющихся и конструирование новых препаратов бактериофагов. В отличие от химиотерапевтических средств фаги действуют избирательно на клетки определенного вида, не затрагивают представителей нормальной микрофлоры и безвредны для человеческого организма. При создании препаратов бактериофагов необходимо обеспечивать их широкую валентность - полноту лизируемости циркулирующих штаммов. Расширение путей введения фагов а организм требует разработки безбелковых безаллергенных сред для их приготовления, особенно в случае введения фагов детям грудного возраста, а также страдающим диатезами и другими аллергическими заболеваниями. Неотложной задачей является расширение номенклатуры бактериофагов в соответствии со структурой гнойно-септических заболеваний - фаги к клебсиеллам, цитробактериям, провиденциям, гафниям, расширение валентности стафилококкового фага с включением рас, активных не только к золотистым, но и эпидермальным стафилококкам. 4. Цели обучения: - - общая (обучающийся должен обладать ОК и ПК): - способностью и готовностью к формированию системного подхода к анализу медицинской информации, опираясь на всеобъемлющие принципы доказательной медицины, основанной на поиске решений с использованием теоретических знаний и практических умений в целях совершенствования профессиональной деятельности (ПК-3); - учебная:ознакомиться с практическим использованием бактериофагов в медицине и микробиологии на основе теоретических знаний и практических умений обучающийся должен: знать: 1. Умеренные и вирулентные бактериофаги, особенности их взаимодействия с клеткой хозяина. 2. Практическое использование бактериофагов в микробиологии и медицине. уметь 1Установить феномен бактериофагии на плотных и жидких питательных средах, 2.Оценить полученные результаты. 5. План изучения темы:
|
