Реактиви1. Біуретовий реактив: 3,9 г CuSO4×5H2O та 6,7 г Na2-ЕДТА розчиняють в 700 мл дистильованої води. Додають при постійному перемішуванні 200 мл 20%-ного NaOH до кінцевого об¢єму 900 мл; 2. Розчин альбуміну: 5 мл розчину концентрації 100 г/л. 3. Біуретовий реактив: в мірну колбу на 1 л наливають 400 мл 0,2 н р-ну NaOH, додають 9 г калій-натрію виннокислого, перемішують до повного розчинення, додають 3 г CuSO4×5H2O (порошок) та 5 г КJ. Об'єм доводять до мітки 0,2 н розчином NaOH 4. Для визначення білку з біуретовим реактивом у модифікації Ярош: до 300 г сечовини (карбаміду) додають кусок тимолу величиною з горошину, приливають 700 мл дистильованої води. Суміш підігрівають, додають 3 г активованого вугілля, перемішують та фільтрують в мірну колбу на 1 л. Об'єм доводять до мітки дистильованою водою. 5. Розчин білку невідомої концентрації. Матеріали та обладнання ФЕК з довжиною хвилі 540 нм (зелений світлофільт), кювети з довжиною оптичного шляху 5 мм, ваги, термостат на 400 С, мірна колба на 500 мл, штатив з 7 пробірками для кожної бригади, піпетки місткістю 0,1; 1,0 та 5,0 мл. Загальні відомості Світло — це електромагнітні хвилі видимого діапазону спектру. До видимого діапазону належать електромагнітні хвилі в інтервалі частот, що сприймаються людським оком (7.5×1014 — 4×1014 Гц), тобто з довжиною хвилі від 400 до 760 нанометрів (рис. 6.1.). У фізиці термін «світло» має дещо ширше значення і є синонімом до оптичного випромінювання, тобто включає в себе інфрачервону та ультрафіолетову області спектру. Джерело світла (як природнього, так і штучного) можна представити як джерело, що випромінює частинки енергії. Ці частинки називаються квантами світла або фотонами. Енергія фотона залежить від довжини хвилі випромінюваного світла. Одиницею виміру довжини хвилі служить нм (нанометр — це 10-9 м). Спектр електромагнітного випромінення показаний на рис.6.1.
діапазон видимого випромінення
Рис.6.1. Спектр електромагнітного випромінення Середня частина спектра - діапазон довжин хвиль 200-400 нм відповідає близькому ультрафіолетовому випромінюванню, 400-700 нм - видимому випромінюванню, 700-1200 нм - близькій інфрачервоній області спектру (рис.6.2).
Рис. 6.2. Середня частина спектру сонячного випромінення Ультрафіолетове випромінювання помітно впливає на метаболізм нашого організму. Ультрафіолетові промені проникають в шкіру на глубину всього до 1 мм. Загальновідомо, що саме УФ-лучи ініціюють процес утворення ергокальциферолу (вітаміну Д), необхідного для всмоктування кальцію в кишечнику і забезпечення нормального розвитку кісткового скелета у дітей. Крім того, ультрафіолет активно впливає на синтез мелатоніну і серотоніну - гормонів, що відповідають за циркадний (добовий) біологічний ритм. Його дефіцит призводить до депресії, коливань настрою, сезонних функціональних розладів. Саме таким ефектом пояснюється збадьорююча дія весняного сонця, що піднімає настрій і життєвий тонус. Дія випромінювання на епідерміс - зовнішній поверхневий шар шкіри хребетних тварин і людини викликає засмагу шкіри - захисну здатність до впливу випромінення. У більших дозах призводить до опіків, може викликати утворення мутацій та рак шкіри. Видиме випромінювання - це невеликий сектор спектру електромагнітного випромінення, що знаходиться в діапазоні довжин хвиль 400-700 нм (1 нанометр - це 10-9 м). Видимий спектр складається з різних кольорів і кожному з них відповідає певний діапазон довжин хвиль, а саме: фіолетовий - 400-440 нм помаранчевий - 595-620 нм
Ширина видимого спектру залежить від конкретної людини і може бути дещо ширшою в діапазоні приблизно від 380 до 760 нм. Теорія колірового зору пояснює, чому ділянка спектру, що знаходиться в межах від 400 до 700 нм, має кольорове забарвлення і чому ми бачимо випромінювання в діапазоні 400-450 нм фіолетовим, 450-480 - синім і т. д. Суть теорії в тому, що світлочутливі нервові закінчення, які знаходяться в одній з оболонок ока і називаються фоторецепторами, реагують на випромінювання видимої частини спектру. Око містить три групи таких рецепторів, з яких одна найбільш чутлива до інтервалу 400-500 нм, інша - 500-600 нм, а третя - 600-700 нм. Рецептори реагують на випромінювання відповідно до їх спектральної чутливості, і відчуття усіх кольорів виникає в результаті комбінації трьох видів рецепторів. Інфрачервоне (ІЧ) випромінювання - ще називається тепловими променями. Довжина хвиль інфрачервоного діапазону понад 760 нм. Інфрачервоне випромінювання також називають "тепловим" випромінюванням, оскільки інфрачервоне випромінювання від нагрітих предметів сприймається шкірою людини як відчуття тепла. При цьому довжини хвиль, що випромінюються тілом, залежать від температури нагрівання: чим вище температура, тим коротше довжина хвилі і вище інтенсивність випромінювання (рис. 6. 3).
Рис.6.3. Зображення людини в інфрачервоних променях. Червоний колір випромінюють більш нагріті частини тіла Залежно від довжини хвилі змінюється проникаюча здатність інфрачервоного випромінювання. Найбільшу проникаючу здатність має короткохвильове інфрачервоне випромінювання, яке проникає в тканини людини на глибину в декілька сантиметрів. Інфрачервоні промені довгохвильового діапазону затримуються в поверхневих шарах шкіри. Особливістю застосування ІЧ-випромінювання в харчовій промисловості є можливість проникнення електромагнітної хвилі в такі капілярно-пористі продукти, як зерно, крупа, борошно і т. п., що застосовується для стерилізації продукту. ІЧ-випромінювання проникає на глибину до 7 мм. Ця величина залежить від характеру поверхні, структури, властивостей матеріалу і частотної характеристики випромінювання. Електромагнітні хвилі певного частотного діапазону чинять не лише термічну, але і біологічну дію на продукт, сприяють прискоренню біохімічних перетворень у біологічних полімерах. Інфрачервоні випромінювачі застосовується в приладах для перевірки грошей. Нанесені на купюру як один із захисних елементів, специальні метамерні фарби можа побачити виключно в інфрачервоному діапазоні. Інфрачервоні детектори валют є самими безпомилковими приладами для перевірки грошей на достовірність.
Фотометричні методи визначення концентрації розчинів засновані на порівнянні поглинання при пропусканні світла через стандартний і досліджуваний розчини. Міру поглинання світла розчином вимірюють за допомогою фотоколориметрів і спектрофотометрів. Фотометричні методи аналізу (фотометрія) це сукупність методів спектрального аналізу, заснованих на вибірковому поглинанні електромагнітного випромінювання у видимій, ІЧ і УФ областях спектру молекулами визначуваного компонента або його сполуки з відповідним реагентом. Фотометричний метод аналізу характеризується високою вибірковістю. Цим методом можна визначити концентрації речовин до 1∙10-7 моль/л. Біохімічні аналітичні методи часто закінчуються кольоровою реакцією, в результаті якої прозорий розчин набуває забарвлення, тобто здатність вибірково поглинати (адсорбувати) світло з певною довжиною хвилі. Для аналізу використовують тільки ті кольорові реакції, в яких розвивається забарвлення, пропорційне концентрації досліджуваної речовини. За допомогою фотометрії визначають екстинкцію, або оптичну густину розчину. Оптична густина розчинів прямо пропорційна концентрації поглинаючої речовини. Тому, вимірявши оптичну густину розчину при певній довжині хвилі (поблизу максимуму поглинання), можна визначити концентрацію поглинаючої речовини. Більшість фотометричних приладів побудовано так, що вони безпосередньо вказують на цю величину. Закон Бугера – Ламберта – Бера. При прохожденні випромінення через розчин світлопоглинаючої речовини світловий потік слабшає. Зниження інтенсивності світлового потоку залежить від концентрації поглинаючої речовини і довжини шляху, пройденого світловим потоком через розчин (визначається товщиною кювети). Ця залежність виражається законом Бугера - Ламберта - Бера. Щоб врахувати втрати світла на відбиття та розсіяння в кюветі, порівнюють інтенсивність світла, що пройшло через досліджуваний розчин і розчин порівняння (розчинник). При однаковій товщині шару розчину в обох кюветах, виготовлених з одного матеріалу, що містять один і той же розчинник, втрати на відбиття та розсіяння світла будуть приблизно однакові і зменшення інтенсивності світлового потоку, що пройшов через розчин буде залежати тільки від концентрації речовини. Якщо інтенсивність падаючого потоку позначити як Io, а інтенсивність світлового потоку, що пройшов через розчин як I, то відношення I/Io називають величиною пропускання і позначають як Т (0 £ Т £ 1) (рис. 6.4). I А= lg T = lg ---- = e ∙ l ∙ C, Io де А - поглинання речовини, або оптична густина. Для абсолютно прозорого розчину А = 0, для абсолютно непрозорого – А ®¥. Т - пропускання зразка, тобто відношення інтенсивності світла того, що пройшло через зразок, до інтенсивності світла, що падає; I/Iо - молярна поглинальна здатність речовини; C - концентрація речовини (моль/л); l – товщина світлопоглинаючого шару (товщина кювети), см; e - молярний коефіцієнт поглинання або екстинкції.
Рис. 6.4. Проходження світлового потоку через кювету з розчином
Молярний коефіцієнт поглинання дорівнює оптичній щільності одномолярного розчину з товщиною поглинаючого шару 1 см. Молярний коефіцієнт поглинання - індивідуальна характеристика речовини, він залежить від природи речовини і довжини хвилі і не залежить від концентрації розчину і товщини кювети. Значення e відображає здатність речовини поглинати світло. При визначенні приводиться чисельне значення величини e. Максимально можливе значення e складає» 105. Фотометричні прилади поділяються на 2 великі групи: фотоелектроколориметри і спектрофотометри (таблиця 6.1). Таблиця 6.1 Фотометричні методи аналізу
Фотоелектроколориметри застосовуються для визначення концентрації забарвлених розчинів за їх здатністю до світлопропускання (оптична густина) або оптичної щільності забарвлених розчинів. Колір розчину пов'язаний з довжиною хвилі поглиненої частини світлового потоку (таблиця 6.2.). Таблиця 6.2. Залежність кольору речовини від довжини хвилі поглинутого світла
Сучасні прилади дозволяють проводити виміри у видимій області спектра (400-760 нм) і в тих, що примикають до неї: ультрафіолетовій (300-400 нм) та інфрачервоній (760-1000 нм) областях. У видимій області колір розчину обумовлений довжиною хвилі випромінювання, не поглиненого цим розчином, і є додатковим до кольору поглиненої частини світла. Якщо речовина не забарвлена, то проводять реакцію, в результаті якої утворюються забарвлені розчинні сполуки.
Принцип роботи ФЕК. Фотоелектроколориметр застосовується для визначення концентрації забарвлених розчинів за їх здатностю до світлопропускання (оптична густина). Прилад працює від мережі змінного струму. В якості джерела світла в приладі використовують лампу “Л” розжарювання (для роботи у видимій частині спектру) та ртутно-кварцеву лампу високого тиску (для вимірювання в ультрафіолетовій частині спектру). Величину світлового потоку виражають в одиницях оптичної густини (екстинкція). Схема однопроменевого фотоелектроколориметра представлена на рис.6.5.
Рис.6.5. Принципова схема будови фотоелектроколориметра
Принцип роботи фотоелектроколориметра полягає в порівнянні інтенсивності потоків світла, що пройшло через розчин порівняння і через досліджуваний розчин (Рис. 3.2.). Світлові пучки від лампи "Л" відбиваються від дзеркала "З1" і "З2", проходять через світлофільтри "С1" та "С2" (пропускає випромінювання лише певної довжини хвилі). Монохроматичне випромінювання спочатку проходить через кювету з чистим розчинником, потрапляє на фотоелемент і за допомогою поглинаючого оптичного клину показання вимірювального приладу встановлюють точно на 100 відсотків пропускання. Потім замість кювети з розчинником на шляху променя вміщують кювету з досліджуваним розчином - вимірювальний прилад відразу показує його коефіцієнт пропускання і оптичну щільність, за якими можна визначити концентрацію поглинаючої речовини в розчині. Джерела випромінювання, що використовуються фотометрії це випромінювачі безперервного спектру. Це вольфрамові лампи розжарювання, газонаповнені лампи (воднева, ртутна). У лампі розжарювання вольфрамова спіраль дає світло в широкому спектральному інтервалі, проте, скло пропускає світло з довжинами хвиль 350-1000 нм, тобто ближній ультрафіолет, видиме світло і випромінювання ближній ІЧ- області. У водневій (дейтерієвій, ксеноновій) лампах відбувається світіння газу при розряді - виникає суцільне випромінювання в області 200-350 нм. Світлофільтри. Для того, щоб з усієї видимої області спектру виділити промені певних довжин хвиль у фотоколориметрах на шляху світлових потоків перед поглинаючими розчинами встановлюють вибіркові поглиначі світла - світлофільтри. Світлофільтри - це забарвлені стекла, що пропускають полоску світла 20 - 50 нм. Світлофільтри пропускають промені лише в певному інтервалі довжин хвиль і практично повністю поглинають промені інших довжин хвиль. Чим вужча область максимального пропускання променів світлофільтру, тим вище його вибірковість до променів цього інтервалу довжин хвиль. Світлофільтри застосовують в колориметрах для виділення спектральної ділянки, в якій аналізований розчин має найбільшу величину абсорбції(поглинання). Колориметри мають набір світлофільтрів, що безперервно перекривають усю видиму ділянку спектру. Вибір світлофільтрa. Вфотоелектроколориметрахспектральні діапазони виділені за допомогою світлофільтрів, тому число ділянок спектра з певною довжиною хвилі, в якому може проводитися вимірювання на даному приладі, дорівнює числу світлофільтрів і вказане на панелі приладу. Вибраний світлофільтр повинен мати мінімальне поглинання свідлофільтра, що співпадає з максимальним поглинанням досліджуваного розчину (рис.6.6).
довжина хвилі, нм
Рис. 6.6. Поглинання світлового потоку: 1- досліджуваний розчин; 2 - світлофільтр Для вибору світлофільтра, який найбільш підходить для проведення фотометричних вимірювань, досліджуваний забарвлений розчин наливають у кювету та вимірюють його абсорбцію за допомогою усіх наявних у приладі світлофільтрів, будують криву, відкладаючи на горизонтальній осі довжину хвиль (у нм), а на вертикальній – значення оптичної щільності. Визначають світлофільтри, що відображають найбільшу величину абсорбції. Із двох близьких за областями пропускання світлофільтрів обирають той, при роботі з яким чутливість приладу, що оцінюється за максимальним значенням абсорбції, є найвищою. Спектрофотометри – це прилади більш високого класу, ніж фотоелектроколориметри. Принцип роботи спектрофотометра (рис.6.7.). Від джерела випромінювання 1 світловий потік за допомогою системи дзеркал розділяється на два рівноцінні потоки (промені). Один промінь проходить через кювету 11, в якій знаходиться розчинена речовина, а інший через кювету порівняння 2, в якій знаходиться розчинник. Обидва світлові потоки проходять модулятор 4 - дзеркальну пластину, що швидко обертається, влаштовану так, що, обертаючись, вона по черзі перекриває один з променів і пропускає інший.
Рис.6.7. Принципова блок-схема двопроменевого спектрофотометра
Промені, пройшовши модулятор 4, потрапляють по черзі у вхідну щілину монохроматора 5, який складається з вхідної спектральної щілини, призми або дифракційної решітки де промені розкладаються, фокусуючого об'єктива і вихідної спектральної щілини, яка виділяє випромінювання вузького інтервалу довжини хвилі. Можливість вибору потрібного спектрального діапазону забезпечується шляхом повороту спеціального механізму в різних моделях може здійснюватися вручну (послідовно перебираючи необхідні довжини хвиль) або автоматично (за допомогою програмного забезпечення). Вузька ділянка спектру променів подається на фоточутливий пристрій 6, в якому світловий потік перетвориться в електричний сигнал, що відповідає йому. Електричні сигнали поступають на обладнання порівняння 7, яке віднімає один сигнал з іншого. Різниця двох сигналів подається на підсилювач 8 і самописець 10, система управління яким відградуйована у відсотках оптичної щільності. Самописець 10 реєструє спектральну криву поглинання, що складається з набору піків різної висоти і ширини, частот, що знаходяться в досліджуваному діапазоні УФ, видимої або ІЧ області спектра. Джерелом випромінювання у видимій і ближній ІЧ області спектра є розжарена вольфрамова нитка лампи розжарювання (350-1000 нм). Для отримання випромінювання УФ діапазону використовують водневі або криптонові лампи, для отримання потужних світлових пучків - ртутні лампи високого тиску. ІЧ випромінювання отримують за допомогою спеціальних джерел, виконаних з платини. Спектрофотометри дають можливість записати спектр поглинання речовини (рис.6.8).
Рис. 6.8. Спектр поглинання вітаміну А (суцільна лінія) і продигіозину (пунктир) в УФ і видимому світлі
Усі елементи оптичної системи приладу, у тому числі і робочі кювети, мають бути максимально прозорі. Найбільш широко поширеним матеріалом для виготовлення кювет є кварц. Розчин порівняння. Вимірювання оптичної щільності стандартного і досліджуваного розчинів завжди проводиться по відношенню до розчину порівняння. В якості розчину порівняння можна використати усі компоненти розчину, окрім реагенту, що утворює забарвлене з'єднання. У тому випадку, коли сам реагент має забарвлення, розчин порівняння готують таким чином: до невеликої кількості дистильованої води додають реагент і усі компоненти (окрім визначуваного) в тих же кількостях, що і при приготуванні забарвлених розчинів. Кювети. Досліджувану речовину розчиняють у відповідному розчині і вміщують в оптично прозору посудину для вимірів - кювету. Оскільки скло поглинає ультрафіолетове світло, для проведення вимірювання в ультрафіолетовій області спектра використовують кварцеві кювети. Для вимірювання у видимій області можна використати пластикові або скляні кювети. При роботі з леткими або хімічно активними речовинами кювети закривають кришками. Оскільки кювета, вміщена в спектрофотометр, стає складовою частиною його оптичної системи, з нею треба поводитися дуже акуратно. Подряпини і бруд на стінках кювети розсіюють і поглинають світло, спотворюючи результати вимірювання. Про це особливо потрібно пам'ятати при роботі в ультрафіолетовій області. Кювети можна протирати м'якими тканинами, наприклад, з бавовни. Не рекомендується використати для цих цілей фільтрувальний папір. Оскільки органічні молекули поглинають в ультрафіолетовій області, ні в якому разі не можна торкатися пальцями оптичних (прозорих) стінок кювети. Кювети досить крихкі, особливо кварцеві, тому працювати з ними потрібно обережно, не допускаючи механічних ушкоджень. Вміст кювети має бути гомогенним - це необхідна умова отримання відтворюваних даних. Треба стежити за тим, щоб розчин не був мутним. Особливо заважають вимірам бульбашки повітря, що дуже збільшують розсіяння світлового потоку. Не можна наливати в кювету дуже холодний розчин, оскільки при цьому на зовнішніх стінках кювети конденсується пар і її стінки стають непрозорими. Якщо кювети забруднені сторонніми домішками, їх слід промити дистильованою водою або розчинником, в якому розчинена досліджувана речовина. Кювети можна мити м'якими детергентами. Не рекомендується мити кювети концентрованими кислотами або лугами. Кювети треба заповнювати до такого рівня, щоб потік світлового випромінювання проходив цілком через шар розчину. Найчастіше використовуються кювети з оптичним шляхом 1 см, в які зазвичай заливають 2,5-3 мл розчину. У такі кювети входить 4-5 мл, але заповнюють їх не повністю. Є кювети з оптичним шляхом 50, 20, 5, 2 і 1 мм. Побудова калібрувальної кривої. Концентрація білку в досліджуваному розчині визначається за калібрувальною кривою.Калібрувальна крива відображає залежність між абсорбцією (А), що називається також оптичною щільністю (D) або екстинкцією (Е) та концентрацією (С) речовини в серії стандартних розчинів. Для побудови калібрувального графіка готують серію стандартних розчинів з відомою концентрацією речовини. В якості стандарту можна використати альбумін сироватки крові бика або яєчний альбумін. Перед приготуванням стандартного розчину альбумін висушують в вакуумі при 600С до постійної маси. Стандартні розчини повинні готуватися особливо ретельно з наважки, отриманої на терезах дуже точного зважування (наприклад, аналітичних). Стандартні речовини для приготування таких розчинів повинні мати високий ступінь чистоти та достатню стабільність, не були гігроскопічними і не взаємодіяли із газами повітря. Наважка повинна бути достатньо великою, що дозволяє зменшити технічну помилку під час зважування. Цьому сприяє зважування стандартної речовини не у звичайному бюксі, а на поліетиленовій плівці із подальшим кількісним повним перенесенням речовини у скляний мірний посуд. Речовина перед зважуванням має бути висушена до постійної маси у сушильній шафі при температурі 110 °С. Мірний посуд, що використовується для отримання стандартних розчинів, необхідно попередньо ретельно знежирити та вимити. Не рекомендується сушити мірний посуд у сушильний шафі, оскільки за високої температури змінюється його об’єм та порушується градуювання. Розведення стандартної речовини повинні не тільки охоплювати діапазон фізіологічних концентрацій, але й виходити за межі їх мінімальних та максимальних величин. У більшості випадків ряд калібрувальних розчинів отримують шляхом розбавлення основного (маточного) розчину. Відомо, що чим концентрованішим є розчин стандартної речовини, тим довше вона зберігається у ньому. Щоб приготувати маточний розчин на аналітичних вагах робимо наважку 0,5 г ліофілізованого альбуміну, обережно переносими його в колбу і додаєм 4,5 мл фізіологічного розчину. Легкими обертальними рухами перемішуємо вміст колби до повного розчинення. Зберігати такий розчин можна при температурі від +2 до +40С. Для побудови калібрувального графіка з основного стандартного розчину білка (1 мл основного стандартного розчину містить 0,1 г білку) готують робочі стандартні розчини, як зазначено в таблиці 6.3. Для кожної точки роблять не менше 3 визначень (готують 3 розчини однакової концентрації). Вимірюють оптичну щільність розчинів проти розчину порівняння, поглинання якого приймають рівним нулю. Вимірювання починають з розчину меншої концентрації. Таблиця 6.3. Приготування робочих розчинів для побудови калібрувальної кривої
Сутність побудови калібрувальної кривої зводиться до того, що певні об’єми розчинів стандартних проб обробляються в умовах, повністю ідентичні умовам аналізу дослідних проб. Калібрувальна крива прокладається таким чином, щоб найбільша кількість точок розташовувалися на лінії, а решта – поблизу неї, рівномірно відхиляючись від неї. Окремі точки, що значно відхиляються від калібрувальної кривої, є наслідком грубих помилок під час визначення, виключаються із обліку. Розташування кривої має бути таким, щоб вона виходила із нульової відмітки під кутом приблизно 45° до осей координат, адже за таких умов досягається найбільша точність вимірювань. Цьому сприяє також вибір достатньо великого масштабу. За отриманим даними будують калібрувальний графік на міліметровому папері. На осі абсцис позначають значення концентрацій в г/л, на осі ординат – середні значення екстинкції для кожної концентрації білку. Через отримані точки проводять пряму лінію (рис.6.9.). Побудова калібрувального графіка проводиться не менше, ніж за 5 точками. екстинкція
|
