Поглинання

концентрація білку, г/л

Рис. 6.9. Побудова калібрувального графіка

Іноді характер графіка для більшості концентрацій білку трохи відхиляється від прямої лінії, однак якщо результати стабільно повторюються, такий графік цілком придатний для роботи.

У правому верхньому куті аркуша із калібрувальним графіком вказують: назву калібрувальної кривої, метод дослідження, довжину хвилі (номер світлофільтра), довжину оптичного шляху (у мм), дату побудови калібрувальної кривої. Враховують також, що у більшості фотометрів найбільш оптимальною є область досліджень у межах 0,1- 0,3 (максимум – 0,7) од. абсорбції.

Калібрувальну криву потрібно час від часу перевіряти. При цьому досить перевірити 2–3 точки. Якщо вони укладаються на колишньому графіку, то він не переробляється.

Побудова калібрувальної кривої залежить від умов, що можуть впливати на її розміщення відносно осей системи координат, тобто, на порушення прямої залежності між концентрацією та величиною екстинкції:

- наявність у середовищі електролітів, що змінюють структуру молекул речовини або ж забарвлених розчинів;

- гідратація (сольватація), що впливає на поглинання розчином світлового потоку, адже зі зміною концентрації розчину змінюється і сам цей процес;

- неповна взаємодія досліджуваної речовини із реактивом при його розбавленні;

- зміни рН розчину, що впливає на повноту утворення та склад молекул забарвленої речовини.

Після побудови калібрувального графіка вимірюють оптичну щільність аналізованого розчину і по графіку визначають його концентрацію.

Хід роботи

Визначення концентрації білку в розчині з біуретовим реактивом.Діапазон вимірювань - від 5 до 100 г/л.

Біуретова реакція обумовлена наявністю в молекулі білків пептидних зв'язків, які у лужному середовищі утворюють комплексні сполуки з іонами Сu²⁺ з утворенням продукту фіолетового кольору, інтенсивність якого пропорційна вмісту білку в розчині.

Для визначення концентрації білку в невідомому розчині, за необхідності, готують розведення такого розчину і, згідно методики, вимірюють його ∆D.

Для досліду беруть три пробірки. У 1-шу (контрольну) пробірку вносять 0,1 мл 0,9% розчину NaCl, у 2-гу та 3-тю (дослідні) по 0,1 мл розчину білку невідомої концентрації. В усі три пробірки добавляють по 2 мл біуретового реактиву, обережно перемішують і через 30 хвилин визначають екстинкцію на ФЕК розчину 2-ої та 3-ої пробірки проти контролю (1-ша пробірка) в кюветі 5 мм при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільт).

Визначення концентрації білку з біуретовим реактивом в модифікації Ярош. Діапазон вимірювань - від 0,04 до 1,6 мг/мл.

В три пробірки приливають 2,4 мл розчину сечовини, в 1-шу пробірку додають 0,1 мл води (контроль), в 2-гу та 3-тю – по 0,1 мл розчину білків невідомої концентрації. Потім у всі пробірки додають 2,5 мл біуретового реактиву. Суміш старанно перемішують, інкубують в термостаті при 40⁰ С протягом 10 хвилин і охолоджують до 20⁰ С протягом 30 хвилин. Розчин колориметрують на ФЕК при довжині хвилі 540 нм в кюветі 5 мм проти контрольної проби (1-ша пробірка). Концентрацію білку в г/л визначають за калібрувальною кривою.