Студопедия — ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 8
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 8






 

ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ЦИТОХРОМІВ Р450 ТА b5 В МІКРОСОМАЛЬНІЙ ФРАКЦІЇ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ЗА ЇХ СПЕКТРАМИ ПОГЛИНАННЯ

Мета роботи: навчитися визначати вміст ферментного білку в очищеному білковому препараті за спектрами поглинання.

План

1. Аналіз білків in vitro.

2. Біохімічні методи дослідження білків.

3. Методи генної інженерії.

4. Ферменти. Роль атомів металу в роботі ферментного білку

5. Цитохроми.

6. Питома і молекулярна активність білків.

Матеріали та обладнання

Калькулятор, лінійка, олівець.

 

Загальні відомості

Для здійснення аналізу білків in vitro, необхідна їх очистка від клітинних компонентів. Цей процес зазвичай починається з лізису клітин, за допомогою різних методів, як наприклад ультразвукова дезінтеграція при певних умовах або ручним гомогенізатором, при якому клітинна мембрана руйнується і внутрішній вміст клітини вивільняється у буферний розчин. Далі клітинний екстракт очищують центрифугуванням, яке фракціонує різні клітинні компоненти у фракції, що містять розчинні білки, мембранні ліпіди й білки, клітинні органели і мікросомальну фракцію.

Біохімічні методи дослідження білків. Для вивчення біохімічної активності ферментних білків використовуються численні біохімічні методи, що мають загальну назву дослідження ферментативної активності. Ці методи в більшості випадків проводяться in vitro і ставлять за мету вимірювання кількості перетвореного субстрату або кількості утворених продуктів реакції. Безперервні процеси зазвичай залучають використання оптичних методів, таких як зміна оптичної щільності розчину або його флюоресценції, якщо відомі оптичні властивості субстратів або продуктів реакції, або вимірювання виділеного тепла при реакції. Часто застосовуються хроматографічні або радіографічні методи. Хроматографічні методи (наприклад, гелевий електрофорез, високоефективна рідинна хроматографія) використовуються для розділення продуктів реакції. Радіографічні методи використовують радіоактивні маркери одного з атомів у субстраті, замінюючи його на радіоактивний ізотоп, що легко визначається за допомогою фотографічних методів, чутливих до радіонуклідів.

 

Перевагою методів in vitro зазвичай є можливість виділити один або кілька компонентів, що досліджуються, та визначити їх активність.

Методи генної інженерії. За допомогою методів генної інженерії (направленого мутаганезу) дослідники можуть змінити амінокислотну послідовність білка таким чином, що його структура, клітинна локалізація і сприйнятливість до регулювання змінюються. Таким чином можна досліджувати вплив таких змін на функціонування всієї клітини, визначаючи природну роль білка, його функцію.

Поширеним застосуванням методу є повне усунення гену, що кодує даний білок, і дослідження впливу відсутності гену на клітину. Часто, коли білок, що відповідає за певну функцію, невідомий, проводиться так званий генетичний скринінг, коли за допомогою транспозонів, що вставляються до геному у випадкових місцях, можна отримати мутантів із відповідним фенотипом, а потім знайти положення транспозону, яке викликало мутацію. Встановлені таким чином білки часто називаються за назвою мутантного фенотипу, що спостерігається.

Ферменти це специфічні білки, що виконують в організмі роль біологічних каталізаторів, вони містяться в усіх клітинах організму.

Зміна кількості ферментів в клітині свідчить про ушкоджуючу роль якого-небудь чинника на клітини органу. Клітинні ферменти залежно від локалізації в тканинах ділять на дві групи:

- неспецифічні ферменти, які каталізують загальні для усіх тканин реакції обміну і знаходяться у більшості органів і тканин;

- органоспецифічні ферменти, властиві тільки для певного типу клітин і органів.

Екскреторні ферменти утворюються органами травної системи підшлунковою залозою, слизовою оболонкою кишечника, печінкою, ендотелієм жовчних шляхів. До них відносяться а-амилаза, ліпаза, лужна фосфатаза, цитохроми печінки та ін. В нормі їх активність постійна. При патології, коли блокований будь-який із звичайних шляхів екскреції, активність цих ферментів може збільшуватися або зменшуватися при дії речовин, що інгібують їх функцію.

Вимірювана активність ферментів може бути обумовлена наявністю дуже близьких за властивостями молекулярних форм ферментів, що відрізняються один від одного. Ці різні форми дістали назву ізоферментів.

 

Однією з найбільш характерних властивостей ферментів є їх висока субстратна специфічність. Це означає, що фермент діє чітко тільки на одну речовину (абсолютна специфічність) або на невелику кількість близьких за будовою речовин, що мають однакову функціональну групу з якою і взаємодіє фермент (широка субстратна специфічність). Ступінь специфічності може значно змінюватися у різних ферментів.

Вивчення специфічності ферментних білків дозволило встановити, що субстрат з¢єднується не зі всією молекулою фермента, а з її окремою частиною, яка називається активним центром фермента. Реакція, яку каталізує фермент протікає в активниму центрі.

Ферментні білки, до складу активного центру яких входять атоми металів називаються металоферментами. Іони металів в такому білку утворюють різного типу комплексні сполуки як з ферментним білком, так і з субстратом.

До складу ферментних білків можуть входити катіони: Nа+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cd2+, Cr3+, Cu2+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+ та Al3+ - всього біля 15 металів.

Роль атомів металу в роботі ферментного білку:

– метал є одним з компонентів каталітичного центру;

– атоми металу створюють або стабілізують просторову конформацію активного центру;

– атом металу активує ферментний білок;

– катіон металу пов¢язує активний центр ферменту з молекулою субстрату.

Білок і метал виявляють взаємний вплив. Наявність іону металу в молекулі ферменту впливає на електронний та структурний стан білку і, таким чином, змінює його властивості. З іншого боку, білок створює для металу незвичну стереохімічну просторову будову, що в свою чергу впливає на властивості металу. Біологічна функція деяких металів полягає в запасанні відповідних іонів металів. Такі білки як кональбумін яєчного білку, трансферин плазми крові, зворотно зв¢язують і переносять іони заліза, церулоплазмін переносить іони міді. Є білки, які контролюють концентрацію в організмі іонів кальцію, магнію, цинку на інших металів.

Атоми перехідних металів входять до складу ферментних білків, які беруть участь в ряді біологічних окисно-відновних процесів, задіяні в ферментних системах, що виконують функцію зберігання та транспорту кисню. Найбільш важливими є такі метали як залізо, мідь і кобальт, в меншій мірі, молібден. В реакціях окисно-відновні перетворення іонів металу лежать в основі певних каталітичних процесів, пов¢язані з переносом електронів, окисненням або відновленням субстратів.

Серед металоферментів залізовміщуючі ферментні білки (гемопротеїни) є особливо важливими для біологічних процесів.

Представники цього класу відповідальні за транспорт та зберігання кисню (гемоглобін, міоглобін), перенесення електронів (цитохроми), каталіз окисно-відновних реакцій (оксидази та пероксидази), каталіз розкладення пероксиду водню (каталази).

Залізо входить до складу багатьох ферментних білків - гемоглобіну, цитохромів, пероксидаз, каталаз. Деякі ферменти переносять атоми заліза (ферритин), інші - контролюють його концентрацію (трансферин).

Гемоглобін - це глобулярний білок здатний зв'язувати і переносити молекулярний кисень. Гемоглобін є основним компонентом еритроцитів. У одному еритроциті міститься близько 280 мільйонів молекул гемоглобіну, кожна з яких складається приблизно з 10 тисяч атомів водню, вуглецю, азоту, кисню, сірки і заліза.

Гемоглобін - представник гемопротеїнів. Молекулярна вага гемоглобіну дорівнює 68000. Основна функція гемоглобіну - зворотне зв'язування молекулярного кисню і доставка його в усі клітини організму.

Молекула гемоглобіну складається з чотирьох субодиниць - двох α і двох β субодиниць. Поліпептидний ланцюг кожної з субодиниць специфічним чином укладений навколо великого плоского залізовмісного гема. Усі чотири ланцюги гемоглобіну схожі між собою за формою.

Гем тільки у складі з нативним глобіном здатний лабільно зв'язувати кисень. При поглинанні кисню β-ланцюги гемоглобіну зближуються, при віддачі - розходяться. Положення α-ланцюгів при цьому не міняється. Отже, приєднання і віддача кисню молекулою гемоглобіну супроводжується зміною його структури, що призводить до зміни спектру поглинання гемоглобіну.

Приєднавши молекулу кисню, гемоглобін переходить в оксигеновану форму.

До поширених похідних гемоглобіну відносяться також метгемоглобін і карбоксигемоглобін. У метгемоглобіні залізо знаходиться в тривалентному стані, тоді як в деоксигенированном і в оксигенированном гемоглобіні - в двовалентному. Метгемоглобін утворюється при витримці на повітрі розчинів оксигемоглобіну.

Кожна форма гемоглобіну має спектр поглинання, що характеризується властивою йому залежністю оптичної густини розчину від поглинання при певній довжині хвилі. Найбільш інтенсивною смугою в спектрі поглинання гемоглобіну є смуга Соре, що належить порфириновій частині його молекули.

Спектр поглинання гемоглобіну характеризує інтенсивна Соре в районі 400 нм, а також інші інтенсивні смуги поглинань між 500 і 600 нм, які позначаються як α- і β-смуги (рис. 8.1).

Гемоглобін має велику спорідненість до чадного газу (СО), переходячи при взаємодії з ним в карбоксигемоглобін, що не має здатності оборотно приєднувати кисень. У основі отруєння людейугарным газом лежить освіта в їх крові значних кількостей карбоксигемоглобіну, що призводить до гіпоксії організму.

Форма і функція гемоглобінів різних організмів схожі, але амінокислотний склад їх відрізняється тим сильніше, чим більше організми еволюційно віддалені один від одного.

Цитохроми є особливо важливими для біологічних процесів серед металоферментів залізовміщуючих ферментних білків. Термін «цитохром» означає (cito -клітина; сhromos -колір) «клітинні пігменти». В природі відомо 25-30 різних цитохромів. Всі вони позначаються буквами a, b, c, P і т.д.

Представники цього класу відповідальні за транспорт та зберігання кисню (гемоглобін, міоглобін), перенесення електронів (цитохроми), каталіз окисно-відновних реакцій (оксидази та пероксидази), каталіз розкладення пероксиду водню (каталази). Ізоформи цитохрому Р-450 локалізовані в різних органах та тканинах організму, але найбільша концентрація цих білків знаходиться в гепатоцитах печінки (клітини печінки).

 







Дата добавления: 2015-09-15; просмотров: 519. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Картограммы и картодиаграммы Картограммы и картодиаграммы применяются для изображения географической характеристики изучаемых явлений...

Практические расчеты на срез и смятие При изучении темы обратите внимание на основные расчетные предпосылки и условности расчета...

Функция спроса населения на данный товар Функция спроса населения на данный товар: Qd=7-Р. Функция предложения: Qs= -5+2Р,где...

Аальтернативная стоимость. Кривая производственных возможностей В экономике Буридании есть 100 ед. труда с производительностью 4 м ткани или 2 кг мяса...

Приложение Г: Особенности заполнение справки формы ву-45   После выполнения полного опробования тормозов, а так же после сокращенного, если предварительно на станции было произведено полное опробование тормозов состава от стационарной установки с автоматической регистрацией параметров или без...

Измерение следующих дефектов: ползун, выщербина, неравномерный прокат, равномерный прокат, кольцевая выработка, откол обода колеса, тонкий гребень, протёртость средней части оси Величину проката определяют с помощью вертикального движка 2 сухаря 3 шаблона 1 по кругу катания...

Неисправности автосцепки, с которыми запрещается постановка вагонов в поезд. Причины саморасцепов ЗАПРЕЩАЕТСЯ: постановка в поезда и следование в них вагонов, у которых автосцепное устройство имеет хотя бы одну из следующих неисправностей: - трещину в корпусе автосцепки, излом деталей механизма...

ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ НАСЕЛЕНИЮ В УСЛОВИЯХ ОМС 001. Основными путями развития поликлинической помощи взрослому населению в новых экономических условиях являются все...

МЕТОДИКА ИЗУЧЕНИЯ МОРФЕМНОГО СОСТАВА СЛОВА В НАЧАЛЬНЫХ КЛАССАХ В практике речевого общения широко известен следующий факт: как взрослые...

СИНТАКСИЧЕСКАЯ РАБОТА В СИСТЕМЕ РАЗВИТИЯ РЕЧИ УЧАЩИХСЯ В языке различаются уровни — уровень слова (лексический), уровень словосочетания и предложения (синтаксический) и уровень Словосочетание в этом смысле может рассматриваться как переходное звено от лексического уровня к синтаксическому...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.01 сек.) русская версия | украинская версия