ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИЙ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОДЫ
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПРИ РАБОТЕ С МАТЕРИАЛОМ, СОДЕРЖАЩИМ МИКРООРГАНИЗМЫ I - IV ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 1.3.2569-09
1. Разработаны Федеральным государственным учреждением науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора; Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора; Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора; Федеральным государственным учреждением науки "Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича" Роспотребнадзора; Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора; Федеральным государственным учреждением здравоохранения "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора. 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 декабря 2009 г. N 3). 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22 декабря 2009 г. 4. Введены в действие с 5 апреля 2010 г. 5. Введены взамен: - МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности" (Минздрав России, Москва, 2003); - МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности" (Минздрав России, Москва, 2004); - МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР" (Минздрав России, Москва, 2001).
1. Область применения
1.1. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий, выполняющих работы с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) при исследовании материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I - IV групп патогенности. 1.2. Юридические лица независимо от организационно-правовых форм и форм собственности и индивидуальные предприниматели, осуществляющие деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний, должны иметь на нее лицензию. Деятельность каждого структурного подразделения (микробиологической лаборатории, цеха, производственного участка и т.п.), связанная с использованием ПБА I - IV групп, должна осуществляться на основании санитарно-эпидемиологического заключения (СП 1.3.1285-03; СП 1.3.2322-08 <*>). -------------------------------- <*> Зарегистрированы Минюстом России 15 мая 2003 г., номер 4545; 21 февраля 2008 г., номер 11197.
1.3. Методические указания определяют принципы организации лаборатории и этапы проведения анализа с использованием МАНК: взятие проб, первичная обработка, хранение, условия перевозки, обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение обратной транскрипции и (или) амплификации, секвенирование продуктов амплификации, учет и регистрация результатов исследования биологического материала, пищевых продуктов, материала из объектов окружающей среды. 1.4. Методические указания регламентируют деятельность персонала лабораторий при выполнении исследований с помощью МАНК, проводимых с использованием зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов и оборудования.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)". Минздрав России, 2003. 2.2. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней". Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008. 2.3. СП 1.2.1318-03 "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами". Минздрав России, 2003. 2.4. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности". Госкомсанэпиднадзор России, 1995. 2.5. СанПиН 2.1.7.728-99 "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений". Минздрав России, 1999. 2.6. МУ N 01-19/123-17 "Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции" от 18.10.96. Госкомсанэпиднадзор России, 1996. 2.7. Р 3.5.1904-04 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях". М., 2005.
3. Общие положения
3.1. Процесс амплификации основан на многократном увеличении числа копий фрагмента нуклеиновых кислот (ДНК/(кДНК)/РНК) или усилении сигнала в условиях in vitro, что позволяет обнаружить специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации. 3.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР), амплификация с удалением (вытеснением) цепи (SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация (TMA), реакция амплификации на основе нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), реакция изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей (SSSR или 3SR), амплификация с использованием QB-репликазы, амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и т.д. 3.3. Методы амплификации сигнала: сигнальная амплификация или метод "разветвленной" ДНК (bDNA assay), прямой гибридизационный анализ на основе РНК/ДНК-зондов и т.д. 3.4. Разновидности полимеразной цепной реакции: с "горячим" стартом (hot-start PCR), мультиплексная (мультипраймерная), гнездовая ("вложенная", nested PCR), "инвертированная", ассиметричная, метод молекулярных колоний, длинных фрагментов (Long-range PCR), с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR), универсальная (broad-range PCR), с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR), иммуно-ПЦР (immuno-PCR-IPCR), в режиме "реального времени" (Real-Time PCR), анализ "по конечной точке" (End-point PCR) и т.д. 3.5. Форматы амплификации нуклеиновых кислот в режиме "реального времени": - с применением интеркалирующих флуоресцентных красителей; - использование меченых флуоресцентными красителями олигонуклеотидных зондов, комплементарных участку ампликона (гибридизационно-флуоресцентная детекция), работающих по принципу: гидролиза зондов (линейно разрушаемые зонды (TaqMan)), зондов с инвертированным концевым повтором (молекулярные "маячки", molecular beacons), праймер-зондов ("скорпионы", Scorpions), гибридизации зондов (с резонансным переносом энергии (FRET-технология)), "амплифлюр" (Amplifluor)-технологии и т.д. 3.6. Методы исследования, использующие продукты амплификации нуклеиновых кислот: секвенирование, ДНК-чипы, рестрикционный анализ. 3.7. Методы детекции продуктов амплификации нуклеиновых кислот: - электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле); - гибридизационно-ферментный; - гибридизационно-флуоресцентный (детекция продукта в режиме "реального времени" или регистрация продукта после окончания реакции амплификации ("анализ по конечной точке")). 3.8. Форматы исследования: качественный, количественный. 3.9. Основные характеристики наборов реагентов, используемых для проведения амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I - IV групп патогенности: аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, воспроизводимость. 3.10. Методы амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I - IV групп патогенности используют: - как метод экспресс-диагностики при исследовании биологического материала, взятого от человека, с целью выявления ДНК (РНК) микроорганизмов I - IV групп патогенности и их количественной оценки; - как метод специфической индикации патогенных биологических агентов в объектах окружающей среды и пищевых продуктах; - как ускоренный предварительный тест при выполнении культурального и биологического методов исследования и для идентификации культур; - для определения эпидемиологической значимости изолятов на основании выявления генетических маркеров вирулентности и патогенности, антибиотикоустойчивости; - для таксономической характеристики штаммов на основании выявления специфических видовых, родовых и других маркеров; - для генотипирования штаммов с целью определения их происхождения; - для прогнозирования течения инфекционного заболевания и оценки эффективности проводимой терапии. 3.11. По результатам анализа выдают ответ о наличии (качественный или количественный анализ) в пробе специфических фрагментов ДНК или РНК, имеющих гомологию с определенным участком генома возбудителя инфекционного заболевания, а также о наличии в исследуемом материале генетических маркеров или генетически модифицированных ДНК.
4. Требования к организации работ
4.1. Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I - IV групп патогенности, методами амплификации нуклеиновых кислот (сигнала) связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения персоналом правил биологической безопасности и требований к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами и (или) ампликонами исследуемых проб помещений и оборудования. 4.2. Данные исследования проводят в организациях, имеющих лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний человека, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения данных работ, выданных в установленном порядке. 4.3. Противоэпидемический режим работы лаборатории должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08, регламентирующими работу с микроорганизмами I - II и III - IV групп патогенности соответственно. 4.4. Допускается проведение исследований биологического материала (без предварительного накопления возбудителя) на наличие ДНК (РНК) возбудителей бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции в лаборатории, имеющей санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III - IV групп патогенности (с указанием конкретных видов микроорганизмов), выданное в установленном порядке. 4.4.1. В лаборатории, имеющей санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III - IV групп патогенности, допускается исследование биологического материала, подозрительного на инфицирование микроорганизмами II группы патогенности только в тех случаях, для которых разработаны и утверждены нормативные документы, регламентирующие порядок проведения таких исследований в условиях данной лаборатории.
5. Требования к помещениям и оборудованию лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические диагностические исследования
5.1. При строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части здания, этажа) с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08. 5.2. При отсутствии возможности размещения помещений лаборатории в виде отдельного блока допускается проведение исследований поступающего материала на базе действующей лаборатории (микробиологической, вирусологической, иммунологической и т.д.) при условии организации в ней самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам проведения анализа, поточности движения персонала и материалов. 5.3. Помещения лаборатории должны быть боксированными (боксы с предбоксами), соответствующим образом промаркированы (нумерация или название рабочих зон) и оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением, средствами пожаротушения, естественным и искусственным освещением и быть непроницаемыми для грызунов и насекомых. 5.4. Внутреннюю отделку помещений осуществляют кафелем (пол, стены) или краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств, поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми. 5.5. В помещениях рабочих зон должны быть установлены бактерицидные лампы. Расчет режима работы бактерицидных ламп проводят в соответствии с Р 3.5.1904-04 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях". 5.6. Окна должны быть плотно закрыты, возможно использование светозащитных пленок из материала, устойчивого к действию используемых дезинфицирующих средств. Использование жалюзи (из-за адсорбции ими пыли) запрещено. 5.7. Архитектурно-планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. 5.8. Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений, количество которых определяется используемыми МАНК (прилож. 1 - не приводится): - приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала (рабочая зона 1); - выделения нуклеиновых кислот (рабочая зона 2); - проведения реакции амплификации и учета ее результатов при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции (рабочая зона 3); - учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза и (или) гибридизационно-ферментным методом детекции (рабочая зона 4-1); - учета результатов (детекции) продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования и (или) на ДНК-чипах (рабочая зона 4-2). 5.8.1. В состав лаборатории могут быть включены вспомогательные помещения (комнаты персонала, кабинет заведующего лабораторией, раздевалки для сотрудников, комната приема пищи, туалет, подсобные (складские) помещения), которые должны быть вынесены за пределы рабочей зоны. 5.8.2. Вспомогательные помещения должны располагаться отдельно от рабочих зон (помещений) в соответствии с действующими санитарными правилами, регламентирующими обеспечение безопасности работ с микроорганизмами I - IV групп патогенности. 5.8.3. Необходимо предусмотреть наличие автоклавной комнаты для обеззараживания исследуемого материала, которая может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности. 5.9. В рабочей зоне 1 осуществляют прием материала, его маркировку, регистрацию в специальном журнале, первичную подготовку (концентрирование материала путем центрифугирования, фильтрации, иммуносорбции, суспендирование, перевод сухих и плотных материалов в жидкую фазу и т.д.), объединение или разделение проб на аликвоты, обеззараживание и хранение проб, обеззараживание остатков исследуемого материала. 5.9.1. Допускается проведение в рабочей зоне 1 приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала, исследуемого другими методами диагностики (бактериологическими, вирусологическими, иммунологическими и т.д.). 5.9.2. При работе с микроорганизмами I - II групп патогенности допускается размещение рабочей зоны 1 в помещениях блока для работы с инфицированными животными. 5.10. В рабочей зоне 2 проводят выделение и очистку нуклеиновых кислот микроорганизмов из проб, подготовленных в рабочей зоне 1. 5.11. В рабочей зоне 3 осуществляют приготовление реакционных смесей, проведение обратной транскрипции, амплификации нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции. 5.11.1. Приготовление реакционных смесей для проведения обратной транскрипции и амплификации нуклеиновых кислот осуществляют до доставки в рабочую зону 3 проб, подготовленных в рабочей зоне 2. 5.11.2. Рекомендуется разделить рабочую зону 3 на две подзоны (3а и 3б) и разместить их в отдельных помещениях. В подзоне 3а осуществляют приготовление реакционных смесей и проведение обратной транскрипции. В подзоне 3б проводят амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции. 5.11.3. При необходимости возможно совмещение рабочей зоны 2 и рабочей зоны 3 в одном помещении при наличии в нем отдельных боксов биологической безопасности II или III классов для каждой из рабочих зон. 5.12. Рабочие зоны 4-1 и 4-2 располагают изолированно от рабочих зон 1 - 3 для предотвращения их контаминации продуктами амплификации через воздушный поток. 5.12.1. Рабочая зона 4-1 предназначена для учета результатов продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза и (или) гибридизационно-ферментным методом детекции, а также очистки продуктов амплификации для секвенирования. 5.12.2. Рабочая зона 4-2 предназначена для учета результатов (детекции) продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования и (или) на ДНК-чипах. 5.12.3. При использовании различных методов учета результатов (детекции) продуктов амплификации нуклеиновых кислот (электрофорез, гибридизационно-ферментативный анализ, секвенирование и ДНК-чипы) в рабочих зонах 4-1 и 4-2 выделяют отдельные рабочие подзоны или отдельные боксированные помещения (отдельные изолированные помещения) для каждого типа детекции. Объединение рабочих зон 4-1 и 4-2 запрещено. 5.13. Помещения лаборатории оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08. 5.13.1. В рабочей зоне 3 объем приточного воздуха должен соответствовать объему на вытяжке. 5.13.2. В рабочих зонах 1 и 2 вытяжка должна преобладать над притоком. 5.13.3. Рабочие зоны 4-1 и 4-2 рекомендуется оборудовать автономной системой приточно-вытяжной вентиляции. Вытяжка должна преобладать над притоком. 5.13.4. При разделении зоны 3 на подзоны 3а и 3б, приточно-вытяжная вентиляция в них должна быть выполнена в соответствии с п. 5.13.1 для подзоны 3а и п. 5.13.2 для подзоны 3б. 5.13.5. В условиях жаркого климата разрешается установка кондиционеров в помещениях рабочих зон лаборатории при условии их выключения на время проведения работ с использованием МАНК с последующей дезинфекционной обработкой рабочего места. 5.14. Каждая самостоятельная рабочая зона должна быть оснащена минимальным набором соответствующего лабораторного оборудования в зависимости от ее функционального назначения и риска контаминации (Прилож. 3), необходимым комплектом мебели, пластиковой и стеклянной посуды, расходных материалов, защитной одежды и уборочного инвентаря, используемых только в данном помещении. 5.14.1. Необходимый комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых МАНК. 5.14.2. Лабораторная мебель, оборудование и принадлежности каждой рабочей зоны должны иметь маркировку указанной зоны (помещения), их применение в других рабочих зонах (помещениях) или для других видов исследований не допускается. 5.14.3. Лабораторная мебель, поверхность используемого оборудования должны быть устойчивы к действию моющих и дезинфицирующих средств, ультрафиолетового излучения, поверхность столов не должна иметь трещин и швов. 5.15. Оборудование и измерительные приборы, используемые в работе лаборатории, должны быть зарегистрированы в установленном порядке и исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации, соответствовать нормам безопасности и электромагнитной совместимости. Не реже 1 раза в год измерительные приборы должны подвергаться метрологическому контролю (поверке). 5.16. Лаборатория должна быть обеспечена аптечкой стандартной комплектации для оказания первой медицинской помощи при авариях в соответствии с действующими санитарными правилами, регламентирующими безопасность работ с микроорганизмами I - IV групп патогенности.
6. Требования к проведению работ
6.1. Не допускается проведение работ, связанных с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот в помещениях, где осуществляются культуральные работы по накоплению биомассы биологических агентов I - IV групп патогенности и генно-инженерные работы, в т.ч. получение (клонирование) и выделение рекомбинантных генетических конструкций. 6.2. Исследование материала, содержащего (подозрительного на содержание) микроорганизмы I - IV групп патогенности, МАНК осуществляют специалисты с высшим или средним медицинским или биологическим (ветеринарным) образованием, прошедшие подготовку на лицензированных курсах первичной специализации по работе с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) (только при работе с данными микроорганизмами) или с микроорганизмами III - IV групп патогенности, получившие дополнительное специальное образование на курсах повышения квалификации по молекулярно-биологическим методам диагностики. 6.3. Допуск персонала к работе в лаборатории осуществляется в порядке, регламентированном действующими санитарными правилами проведения работ с микроорганизмами I - IV групп патогенности. 6.4. Выполнение работ в рабочих зонах 4-1 и 4-2 должно осуществляться отдельным персоналом, не задействованным на других этапах проведения анализа. 6.5. При проведении исследований с использованием МАНК неукоснительно соблюдают этапы проведения последовательной обработки материала и проб. 6.5.1. Весь поступающий материал направляют в рабочую зону 1 для приема, регистрации, разбора, первичной обработки и обеззараживания материала. 6.5.2. В рабочую зону 2 материал подлежит передаче только после обеззараживания (Прилож. 5) в маркированных одноразовых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 - 2,0 мл с закрытой крышкой. 6.5.3. После окончания работы в рабочей зоне 2 пробирки передают в рабочую зону 3, где предварительно проведена работа по подготовке реакционных смесей для проведения реакции амплификации. 6.5.4. После окончания работы в рабочей зоне 3, если для учета результатов используется метод электрофореза и (или) гибридизационно-ферментативный метод детекции, пробирки переносят в рабочую зону 4-1 для проведения анализа. 6.5.5. В случае применения для регистрации результатов реакции амплификации секвенирования работы по очистке ампликонов осуществляют в рабочей зоне 4-1 с последующим переносом пробирок в рабочую зону 4-2 для завершения анализа. 6.5.6. Если учет реакции амплификации осуществляют с использованием ДНК-чипов, пробирки из рабочей зоны 3 для проведения анализа переносят в рабочую зону 4-2. 6.6. При проведении исследований с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот неукоснительно соблюдают следующие правила работы: 6.6.1. Обеспечение поточности движения исследуемого материала, проб нуклеиновых кислот, продуктов амплификации. 6.6.2. Забор материала, его предварительную обработку, хранение, перевозку (Прилож. 2) и передачу на исследование в рабочую зону 1 осуществляют согласно инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций, инструкциям к наборам реагентов и в соответствии с СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08. 6.6.3. Передачу исследуемого материала в рабочую зону 1 и проб при смежном расположении помещений рабочих зон 1, 2, 3 (3а и 3б) желательно осуществлять через шлюзовые передаточные окна, а в рабочие зоны 4-1 и 4-2 - через передаточные окна. 6.6.4. Перенос проб из одной рабочей зоны в другую, а также их хранение в данных помещениях рекомендуется осуществлять в плотно закрывающихся металлических (с возможностью опломбирования) или пластмассовых контейнерах (штативах) с их последующей обработкой регламентируемыми дезинфицирующими средствами после каждого использования. 6.6.5. При исследовании материала, подозрительного на зараженность микроорганизмами I - IV групп патогенности, все манипуляции в рабочих зонах 1 и 2, включая манипуляции, сопровождающиеся риском образования аэрозоля (встряхивание, центрифугирование и т.д.) при обработке материала и выделении нуклеиновых кислот, выполняют в боксах биологической безопасности II или III класса (Прилож. 4). 6.6.6. По окончании работы все объекты, инфицированные (подозрительные на инфицирование) микроорганизмами I - IV групп патогенности, помещают на хранение в холодильное (морозильное) оборудование (бытовые и промышленные холодильники (морозильники) и шкафы, холодильные камеры) на время проведения исследований. Рабочее место и рабочие поверхности оборудования подвергают дезинфекции. 6.6.7. Работы в рабочих зонах 3, 4-1 и 4-2 выполняют в боксах биологической безопасности II (I) класса защиты или ПЦР-боксе (Прилож. 4). При работе с материалом, содержащим микроорганизмы III - IV групп патогенности, этапы анализа, выполняемые в рабочих зонах 4-1 и 4-2, проводят на лабораторных столах. 6.6.8. Каждая манипуляция после ее завершения обязательно должна сопровождаться сменой наконечников для автоматических пипеток. 6.6.9. Расходуемые материалы (наконечники, пробирки и т.д.), наборы реагентов должны строго соответствовать используемому оборудованию (автоматическим пипеткам, термоциклерам и т.д.). 6.6.10. Рекомендуется использование источников бесперебойного питания при подключении амплификационного оборудования. 6.6.11. Условия хранения наборов реагентов (комплектов реагентов), образцов проб должны соответствовать инструкциям по применению. Образцы проб, содержащих нуклеиновые кислоты и (или) ампликоны, хранят отдельно от реагентов в разных холодильниках. Не допускается использование несертифицированных наборов, реагентов с истекшим сроком годности, хранившихся в условиях нарушения температурного режима. 6.6.12. Холодильное оборудование должно быть оснащено средствами ручного или автоматического температурного контроля и регистрации, свидетельствующими о реальном режиме хранения наборов реагентов и исследуемых проб.
7. Требования к защитной одежде
7.1. При работе с микроорганизмами I - IV групп патогенности выбор типа защитного костюма (рабочей одежды и средств индивидуальной защиты) проводится в строгом соответствии с СП 1.3.1285-03 и (или) СП 1.3.2322-08 и определяется видом возбудителя, рабочей зоной, оснащением ее боксами биологической безопасности (Прилож. 4). 7.2. Каждая рабочая зона (помещение) обеспечивается необходимым количеством комплектов спецодежды (комбинезон или пижама, медицинский халат, шапочка, одноразовые латексные (резиновые) перчатки и сменная обувь). При работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать одноразовые бахилы. Использование одежды из другой зоны запрещено. Рекомендуется использование одноразовой одежды. 7.3. Надевание и снятие защитной одежды производят в предбоксах. В каждом из них должен быть отдельный комплект защитной одежды и обуви. Наиболее загрязненной продуктами амплификации считается защитная одежда рабочих зон 4-1 и 4-2, особенно латексные (резиновые) перчатки, которые снимают в первую очередь.
8. Требования к обработке помещений и обеззараживанию материала
8.1. Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08. 8.2. Ежедневно в конце рабочего дня проводят текущую влажную уборку полов разрешенными к применению дезинфицирующими средствами. 8.3. Рабочие зоны (помещения) лаборатории должны подвергаться ежедневному обеззараживанию ультрафиолетовым излучением в соответствии с Р 3.5.1904-04 "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях" (М., 2005). 8.4. Каждая рабочая зона (помещения) лаборатории должна быть обеспечена промаркированным набором уборочного инвентаря, не допускается использование индивидуального уборочного инвентаря для уборки других помещений лаборатории. 8.5. Перед началом работы рабочую поверхность столов (биологических боксов) и оборудования обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом. 8.6. При использовании кондиционеров ежемесячно проводят очистку и обработку радиаторной решетки кондиционера и накопителя конденсата 0,2%-ным раствором ДП-2Т с заменой фильтров. 8.7. Не менее чем один раз в год осуществляют обработку автоматических дозаторов. Дозаторы разбирают, обрабатывают моющим раствором для удаления жирового загрязнения, после чего остатки моющего средства удаляются ветошью, смоченной водой. Затем проводят обработку 1 N соляной кислотой; время экспозиции - 1 ч. Остатки раствора тщательно удаляют ветошью, смоченной водой, и проводят обеззараживание влажных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 1 ч. По окончании обработки дозаторы собирают и проводят калибровку в соответствии с прилагаемой инструкцией по пользованию дозаторами. Автоклавируемые дозаторы обеззараживают паром под давлением 1,7 атм. при температуре 120 +/- 1 °С в течение 20 мин. 8.8. Остатки материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I - IV групп патогенности, использованную посуду после дезинфекции регламентируемыми дезинфицирующими препаратами (если необходимо) собирают в закрывающиеся емкости (контейнеры) и передают на автоклавирование. Не допускается слив необеззараженных жидкостей в канализационную сеть. Порядок и режимы обеззараживания исследуемого материала, инактивации пробирок с ампликонами, использованных реагентов и рабочей одежды представлены в Прилож. 5 и 6. 8.9. При возникновении контаминации в помещениях лаборатории, использующей МАНК, немедленно останавливают работы и проводят мероприятия по ликвидации контаминации (Прилож. 7). 8.9.1. При случайном открытии пробирок с продуктами амплификации (рабочая зона 3) необходимо остановить работу, надеть перчатки (при их отсутствии), закрыть пробирки, заменить перчатки, провести мероприятия по ликвидации возможной контаминации (Прилож. 7). 8.10. В лаборатории проводят внутрилабораторный контроль качества дезинфекции и проведенной деконтаминации ампликонов путем исследования смывов с рабочих поверхностей оборудования и поверхностей помещений.
9. Контроль качества проводимых исследований
9.1. В лаборатории, использующей МАНК в диагностических целях, проводят внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал. 9.2. В установленном порядке лаборатория должна принимать участие в мероприятиях (программах) по внешней оценке качества лабораторных исследований (ФСВОК и т.д.) по конкретным нозологическим формам не реже 1 раза в год. 9.3. Внутрилабораторный и внешний контроль качества лабораторных исследований осуществляют путем анализа шифрованных аттестованных контрольных панелей, содержащих "положительные" и "отрицательные" пробы. 9.4. При проведении внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований могут использоваться аттестованные на наличие аналита (его количества) панели производителей коммерческих наборов или внутрилабораторные аттестованные образцы, содержащие и не содержащие нуклеиновые кислоты конкретных возбудителей в различной концентрации, стабильные в условиях хранения.
Приложение 2
ЗАБОР, ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА, ХРАНЕНИЕ И ПЕРЕВОЗКА МАТЕРИАЛА НА ИССЛЕДОВАНИЕ
1. Забор материала, его предварительная обработка, хранение и перевозка, передача исследуемого материала в другие организации осуществляется согласно инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций, инструкциям к наборам реагентов и в соответствии с СП 1.2.036-95, СП 1.3.1285-03 и СП 1.3.2322-08. 2. С целью предотвращения разрушения нуклеиновых кислот рекомендуется использование следующих транспортных сред в зависимости от вида исследуемого материала: - N 1, содержащая: NaCl 137 мМ; KCl 2,7 мМ; NaH PO 10 мМ; K HPO 2 мМ; 2 4 2 4 сыворотку крупного рогатого скота 20%; - N 2, содержащая: сахарозу 0,218 М; KH PO 0,0038 М; K HPO 0,0072 М; 2 4 2 4 БСА 1%; - ESP, содержащая: саркозил 1%; ЭДТА 0,05 М; свободную от нуклеаз проназу Е 1 мг/мл; - специальные транспортные среды, разработанные и рекомендованные производителями наборов реагентов. При необходимости длительного хранения и перевозки в отсутствии низкотемпературных холодильников рекомендуется использовать транспортную среду ESP. Исследуемый материал может храниться в среде ESP при температуре (25 +/- 5) °С в темном месте в течение 10 дней. 3. Перевозку материала (предварительно обработанных проб) для исследования, а также его хранение осуществляют в соответствии с СП 1.2.036-95 в закрывающихся (с возможностью опломбирования) металлических или пластмассовых контейнерах, на дне которых размещают адсорбирующий материал (марлевая салфетка, ткань, вата и пр.), смоченный раствором дезинфицирующего средства. Контейнер помещают в сумку-холодильник или во внешний термоконтейнер с хладагентами. При соблюдении противоэпидемического режима возможна перевозка материала для исследования в металлическом термосе со льдом. 4. Перевозку и хранение материала рекомендуется осуществлять в условиях "холодовой цепи" с обеспечением необходимого контроля установленного температурного режима при помощи термоиндикаторов. 4.1. В зависимости от используемой транспортной среды, вида исследуемого материала и температурного режима сроки перевозки и хранения материала могут варьировать в широком диапазоне. Забор материала на исследование от человека, животных, насекомых и объектов окружающей среды 1. Требования к забору биологического материала. 1.1. Кровь (плазма), сыворотка крови. Пробы крови (плазмы) используют при проведении качественных и количественных исследований, пробы сыворотки крови используют только при проведении качественных исследований с помощью МАНК. Взятие материала Для получения плазмы забор крови производят натощак или через 3 ч после приема пищи из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в специальную вакуумную систему типа "Vacuett" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА) или одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8%-ный раствор цитрата Na в соотношении 1:9). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом (в противном случае кровь свернется и выделение ДНК/РНК станет невозможным). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в одноразовые пробирки без антикоагулянта. Предварительная обработка проб Плазму крови получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800 - 1600 g в течение 20 мин. при комнатной температуре. Затем отбирают плазму в количестве не менее 1 мл отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл. Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин. до полного образования сгустка или помещают в термостат при 37 °С на 15 мин. Затем центрифугируют при 800 - 1600 g
|
