СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

 

ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУ 3.2.1173-02

 

1. Разработаны: Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ММА им. И.М. Сеченова (В.П. Сергиев, О.Г. Полетаева, Т.В. Продеус, Э.Е. Шуйкина, Е.А. Коврова, Н.Н. Красовская), кафедра паразитологии, паразитарных и тропических болезней МПФ ППО ММА им. И.М. Сеченова (Т.В. Старкова, Н.А. Романенко), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Т.Н. Цыбина, Т.Г. Сыскова, Л.Г. Подунова, Т.А. Семенова), Российской Академией последипломного образования (А.Я. Лысенко, Т.Н. Константинова, Т.И. Авдюхина, А.Е. Беляев, М.Г. Владимова), НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея (А.Л. Гинзбург, А.И. Грачева), Омским НИИ природно-очаговых инфекций (О.Ю. Старостина, В.К. Ястребов), Ростовским НИИ микробиологии и паразитологии (Ю.И. Васерин, Т.И. Твердохлебова), Тюменским НИИ краевой и инфекционной патологии (Т.Ф. Степанова, Т.В. Постникова, К.Б. Степанова), Всероссийским НИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина (А.В. Успенский, А.С. Бессонов, Н.В. Шеховцов), ЗАО "Вектор-Бест" (А.В. Масяго).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 ноября 2002 года.

3. Введены впервые.

 

1. Область применения

 

1.1. Настоящие методические указания устанавливают основные методы серологической диагностики паразитарных заболеваний, проводимые аккредитованными, лицензированными лабораториями лечебно-профилактических учреждений, органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы, ведомственных учреждений, научно-исследовательских учреждений и других диагностических (испытательных) лабораторий вне зависимости от ведомственной принадлежности и форм собственности.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий, выполняющих серологические исследования на паразитарные заболевания и использующих медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) отечественного и зарубежного производства, зарегистрированные на территории Российской Федерации и разрешенные к применению Министерством здравоохранения Российской Федерации.

 

2. Нормативные ссылки

 

- Федеральный закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30.03.99.

- Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства РФ N 554 от 24.07.00.

- Положение о санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства РФ N 554 от 24.07.00.

- СанПиН 3.2.569-96 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации".

- СП 3.1/3.2.558-96 "Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний".

- СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

- СП 3.3.2.561-96 "Государственные испытания и регистрация новых лекарственных иммунологических препаратов".

- ОСТ 91 500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств".

- МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды".

 

3. Отбор проб, хранение и транспортирование материала

для серологических исследований

 

Материалом при иммунологических исследованиях может быть биологический материал от людей (сыворотка крови, слюна, фекалии), а также материал из объектов окружающей среды (почва, вода и др.).

Для выявления антител к антигенам гельминтов и простейших у людей иммунологическими методами в настоящее время используется сыворотка крови обследуемого человека.

3.1. Забор крови на исследование проводится по общепринятым гематологическим методикам (забор венозной крови проводят в процедурных кабинетах лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), капиллярной крови - в диагностических лабораториях ЛПУ и других аккредитованных лабораториях).

3.2. Подготовка сыворотки проводится в лабораториях.

3.2.1. Кровь в пробирке отстаивают в течение 1 - 2 ч при комнатной температуре или 0,5 - 1 ч при 37 °С в термостате, предварительно отслоив стерильной пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой сгусток от краев пробирки. Для лучшей ретракции сгустка пробирку помещают в холодильник при 4 °С на 1 - 2 ч или центрифугируют 10 мин. при 3000 об./мин. или 20 мин. при 1500 об./мин. Сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильные стеклянные пробирки (ампулы, флаконы) или полистироловые микропробирки типа "Эппендорф" с крышками.

При массовых обследованиях населения ампулы с сывороткой перед транспортированием и хранением запаивают, избегая нагревания сыворотки, флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками, микропробирки закрывают крышками. Ампулы, флаконы, микропробирки нумеруют согласно приложенному списку больных (обследуемых) или этикетируют с указанием фамилии, имени, отчества больного, даты взятия крови.

3.3. Хранение, транспортирование крови и сыворотки.

Кровь доставляется в лабораторию в день взятия. В этот же день из нее должна быть подготовлена сыворотка, которая может храниться до исследования в холодильнике при 2 - 4 °С не более 4 - 6 дней. При длительном хранении (более 2-х недель) сыворотку необходимо хранить в замороженном виде при температуре -20 - -25 °С, допускается глубокое замораживание до -70 °С. Не допускается замораживание и размораживание сыворотки более 1 раза.

Длительное хранение сывороток приводит к частичной потере активности антител, особенно иммуноглобулинов класса М (IgM).

При массовом заборе крови от населения, при длительном хранении сывороток до исследования (в течение года) и с целью предупреждения потери активности антител необходимо хранить сыворотки в глубоком холоде, при температуре не выше -20 - -40 °С.

До замораживания сыворотку от одного обследуемого можно разлить в несколько полистироловых микропробирок с крышками типа "Эппендорф", что позволяет размораживать не всю сыворотку, а ее отдельную часть.

Транспортирование замороженных сывороток должно быть при тех же температурных условиях, не допускающих размораживания (в сумках-холодильниках или термосах со льдом, можно использовать сухой лед).

Сыворотку перед исследованием необходимо разморозить полностью и тщательно перемешать во избежание потери концентрации антител.

 

4. Общие сведения о инвазиях, выявляемых

серологическими методами

 

В клинической практике серологические методы исследования являются дополняющими к комплексу клинико-инструментальных (эхинококкозы, цистицеркоз, токсокароз) и паразитологических (описторхоз, трихинеллез) показателей для целей дифференциальной диагностики паразитарного заболевания от заболевания со сходной клинической картиной. Серологическая диагностика применяется с целью выявления инвазированных, для оценки эффективности специфической терапии инвазированных, выявления рецидива заболевания.

 

4.1. Основные гельминтозы, выявляемые

серологическими методами

 

Трихинеллез. Возбудитель нематода Trichinella spiralis и ее вариитеты. Острое заболевание, сопровождающееся лихорадкой, развитием отеков, миалгией и эозинофилией крови. При тяжелом течении возможно поражение миокарда, центральной нервной системы. Серологическая диагностика трихинеллеза осуществляется с учетом штаммовых особенностей возбудителя заболевания, а также состояния иммунной системы инвазированного. Выработка специфических антител происходит в период миграции личинок трихинелл и концентрации их в мышцах. Их выявление в серологических реакциях у лиц, заразившихся при употреблении в пищу мяса домашних животных (свиньи) с высокой или средней интенсивностью инвазии трихинеллами (200 - 500 личинок на 1 г мяса) происходит на 15 - 20 сутки после заражения. При меньшей интенсивности инвазии сроки выявления антител удлиняются. При заражении людей от диких животных (медведь, кабан, барсук, нутрия) антитела выявляются спустя 4 - 6 недель. В течение 2 - 4 месяцев показатели серологических реакций могут нарастать. Через 4 - 5 месяцев после заражения эти показатели снижаются, однако остаются на диагностическом уровне не менее 1,5 лет, а при интенсивном заражении до 2 - 2,5 и более лет.

Для ранней серологической диагностики трихинеллеза желательна одновременная постановка двух серологических реакций, например, одновременно реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и иммуноферментного анализа (ИФА). Совпадение их результатов свидетельствует о правильности диагноза.

Чувствительность ИФА и РНГА достигает 90 - 100%, а специфичность - 70 - 80%. Результаты двух реакций совпадают в 80 - 90% случаев. Ложноположительные результаты анализа чаще наблюдаются при острой фазе ряда гельминтозов (описторхоз, клонорхоз и др.), в связи с чем для дифференциального диагноза требуется тщательное изучение клинико-эпидемиологического анамнеза. Серологический диагноз трихинеллеза ставится на основании 4-кратного прироста титра антител. При невозможности исследования сыворотки в начале заболевания исследуется сыворотка крови, полученная в период реконвалесценции. У больных с подозрением на трихинеллез при первичном получении отрицательного или сомнительного результата реакции исследование крови необходимо повторить через 10 - 14 дней, нарастание титров подтверждает инвазию трихинеллами.

Специфическая терапия трихинеллоцидными препаратами вызывает подъем титров антител, которые сохраняются в диагностических значениях на протяжении 6 - 12 месяцев, а затем снижаются. У лиц с подозрением на трихинеллез и получавших превентивное лечение серологическое обследование проводят через 2 - 3 недели после лечения. У переболевших трихинеллезом антитела сохраняются в течение длительного времени - от 2-х и более лет.

При массовых обследованиях населения на трихинеллез сыворотки крови исследуют в одном диагностическом разведении методом скрининга, как указывается в инструкциях к тест-системе ИФА и диагностическому набору РНГА. В случае положительного результата анализа у обследованных и при наличии у них клинической картины трихинеллеза сыворотку титруют в последовательных двукратных разведениях, начиная от диагностического.

Показания к серологическому обследованию:

- наличие клинических симптомов (лихорадка неясного генеза, отек лица, миалгия, эозинофилия и др.); при миокардитах, менингоэнцефалитах неясного генеза, при лейкемоидной реакции по эозинофильному типу неясного генеза у пациентов, употреблявших в пищу свинину, медвежатину, кабана и мясо других животных - потенциальных хозяев трихинелл;

- расшифровка случаев групповой заболеваемости трихинеллезом (вспышки) и выявление контактных на эндемичных территориях (на неэндемичных территориях: при наличии в эпиданамнезе указаний на употребление в пищу мяса и мясопродуктов из свинины, медвежатины и других животных - потенциальных хозяев трихинелл).

Описторхоз. Возбудитель трематода Opisthorchis felineus. Трематодоз печени, протекающий на ранней стадии в виде острого аллергоза с высокой эозинофилией крови, на поздней - с преимущественным поражением гепатобилиарной системы, с умеренно повышенным или нормальным уровнем эозинофилов.

Серологическая диагностика описторхоза на ранней фазе заболевания, до начала яйцепродукции паразитом, является единственным методом лабораторной диагностики, при хроническом описторхозе является вспомогательным методом, при котором требуется подтверждение паразитологическими методами диагностики. Чувствительность реакции (ИФА и РНГА) в острую фазу приближается к 100%, в хронической фазе заболевания - до 70%, и зависит от интенсивности инвазии. Ложноположительные результаты анализа возможны при исследовании сыворотки здоровых лиц в 1,0%, больных непаразитарными заболеваниями (аллергозы, патология желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарной системы, системные заболевания) - в 1,5%, токсоплазмозом - в 5,6%, токсокарозом - в 7,3%, эхинококкозом - в 15,4%, трихинеллезом - в 20,0%, фасциолезом - в 29,4% случаев.

В очагах описторхоза у коренных жителей наблюдаются низкие показатели серологических реакций вследствие врожденной толерантности. У пришлого населения (рабочие-вахтовики, переселенцы и др.) вследствие отсутствия врожденной невосприимчивости к заражению описторхисами, как правило, регистрируются высокие показатели серологических реакций.

При серодиагностике возможно получение ложноотрицательных результатов на фоне иммунодефицитных состояний вследствие сопутствующих хронических заболеваний или индуцированных приемом медикаментов (антибиотиков, глюкокортикостероидов, химиопрепаратов).

Показания к серологическому обследованию:

- высокая эозинофилия крови или лейкемоидная реакция по эозинофильному типу у лиц, употреблявших в пищу речную рыбу;

- лица, работавшие или проживавшие в эндемичных по описторхозу районах, а в настоящее время страдающие заболеваниями желчевыводящих путей.

Эхинококкозы. Возбудитель однокамерного эхинококкоза - личиночная форма цестоды Echinococcus granulesus, многокамерного эхинококкоза - Echinococcus multilocularis. Тяжелые, хронически протекающие гельминтозы с поражением печени и других органов, приводящие в части случаев к инвалидизации и летальным исходам.

Серологические реакции при эхинококкозах используют для первичной диагностики, для оценки результатов оперативного и консервативного лечения и наблюдения за больными в динамике, для раннего выявления рецидивов заболевания. Локализация и жизнеспособность ларвоцист эхинококка гидатидозного и альвеолярного, интенсивность инвазии, а также состояние иммунной системы хозяина влияют на интенсивность антителообразования и выявляемость инвазированных с помощью серологических реакций.

Наиболее эффективными для диагностики эхинококкозов являются реакции РНГА и ИФА, с помощью которых выявляются до 90 - 98% инвазированных, независимо от видовой принадлежности паразита. Совпадение двух реакций наблюдается в 90% случаев.

Максимальная выявляемость эхинококкозов серологическими методами (до 98%) наблюдается при локализации эхинококковых пузырей живого паразита в печени, брюшной полости и забрюшинном пространстве, а также при множественном и сочетанном поражении. При поражении легких, а также при наличии 1 - 3 кист небольшого (до 2 см) размера эффективность серологической диагностики ниже и колеблется в пределах 70 - 80%. Наименее информативны серологические методы диагностики при эхинококкозе нервной (спинной или головной мозг, глаз), мышечной или костной ткани, а также при погибшем и обызвествленном паразите. В этом случае чувствительность диагностических препаратов не превышает 40%. При серологической диагностике эхинококкозов возможна регистрация ложноположительных результатов, возникающих при наличии в крови неспецифических антител, сходных по структуре с антителами к эхинококку. Наиболее часто ложноположительные результаты выявляются при соматических и инфекционных заболеваниях, сопровождающихся обширными деструктивными процессами в пораженных органах (цирроз печени, туберкулез легких и других тканей, онкологические заболевания). Возникновение ложноположительных реакций возможно при других гельминтозах (описторхоз, фасциолез и цистицеркоз).

Низкие титры антител могут быть выявлены в ранний период болезни (кисты диаметром до 2 см), а также при обызвествленных оболочках ларвоцист; резкое снижение титров может наблюдаться при далеко зашедшем процессе, в поздней, неоперабельной стадии эхинококкозов. Высокие титры антител могут быть выявлены у больных с активным процессом, чаще локализованном в органах брюшной полости; в случае легочной локализации кисты эхинококка (даже при наличии кисты больших размеров) титры антител могут быть низкими.

Показания к серологическому обследованию:

- наличие объемного образования или кист в печени и других органах;

- эпидзначимые контингенты - лица, относящиеся к группам риска (охотники и члены их семей; зоотехники; чабаны и пастухи; работники кожевенных предприятий, т.д.), лица, проживающие в очагах эхинококкозов.

Токсокароз - вызывается мигрирующими личинками аскаридат собак Toxocara canis. Инвазия с длительным рецидивирующим течением, полиморфными клиническими проявлениями и высокой эозинофилией периферической крови.

Серологическая диагностика токсокароза основана на результатах реакции ИФА с антигеном токсокар при исследовании сыворотки крови у лиц с характерным комплексом симптомов: лимфаденопатия, гепатомегалия, бронхит, бронхиальная астма неясного генеза, уртикарная сыпь на фоне эозинофилии крови, лейкемоидная реакция эозинофильного типа с характерным эпиданамнезом (например: геофагия) и др.

У пациентов, имеющих симптоматику, характерную для токсокароза, титры антител (АТ) в ИФА 1:800 и выше подтверждает клинический диагноз. У лиц при отсутствии клинической симптоматики титр АТ в ИФА 1:400 и ниже свидетельствует о контакте человека с возбудителем без развития патологического процесса. Ложноположительные результаты анализа могут наблюдаться у лиц с системными лимфопролиферативными заболеваниями и нарушениями в системе иммунитета. Это определяет необходимость проведения анализа клинической картины заболевания. Ложноотрицательный и сомнительный результат анализа может наблюдаться у лиц с поражением токсокарами глаз в результате слабого антигенного воздействия. Лиц с низким положительным результатом ИФА (титр 1:200 - 1:400) ставят на диспансерный учет и каждые 3 месяца проводят серологическое исследование. При появлении клинической картины заболевания и повышения титров специфических АТ врач принимает решение о необходимости проведения лечебных мероприятий.

 

4.2. Основные протозоозы, выявляемые

серологическими методами

 

Токсоплазмоз. Возбудитель внутриклеточные простейшие Toxoplasma gondii. Широко распространенное протозойное заболевание, характеризуется полиморфизмом клинических проявлений от бессимптомного носительства до выраженных клинических проявлений. Серологическая диагностика токсоплазмоза осуществляется с помощью ИФА для выявления IgM- и IgG-антител и реакции иммунофлюоресценции (РИФ). Является важной для дифференциальной диагностики от заболеваний со сходной клинической картиной. Сроки выявления специфических антител и кинетика смены концентраций иммуноглобулинов обоих классов индивидуальны и зависят от интенсивности инвазии и иммунного статуса инвазированных. В ряде случаев выявление иммуноглобулинов класса IgM в РИФ и ИФА наблюдается через 7 - 12 суток после заражения в невысоких титрах. Через 2 - 3 месяца эти показатели достигают максимума, а через 3 - 4 месяца исчезают. Концентрация антител, относящихся к иммуноглобулинам класса IgG, достигает максимума к концу 2 месяца инвазии, затем снижается, но остается повышенной в течение всей жизни инвазированного.

Рекомендуется повторное обследование лиц с положительными титрами на токсоплазму через 10 - 14 суток для установления динамики развития болезни. Отсутствие увеличения титров антител свидетельствует о хроническом токсоплазмозе. Увеличение титров на 3 - 4 разведения сыворотки свидетельствует об активном течении инвазии. Возможна иная схема кинетики выявления в РИФ и ИФА иммуноглобулинов классов М и G.

Высокие титры IgM свидетельствуют об острой стадии болезни. Высокие титры IgG могут свидетельствовать об обострении хронической инфекции, если есть клинические проявления, характерные для токсоплазмоза. Низкие титры IgG указывают на субклиническую, латентно протекающую инфекцию. Повышение и понижение титров антител можно считать достоверными, если разница предыдущего и последующего исследования различается по крайней мере на 4 разведения.

Показания к обследованию на токсоплазмоз:

- беременные женщины по показаниям, с сероконверсией;

- больные токсоплазмозом, получающие специфическое лечение;

- дети, рожденные от матерей с отягощенным анамнезом по токсоплазмозу;

- эпидзначимые контингенты: ветеринарные и другие специалисты, связанные в работе с кошками и собаками;

- больные с клиническими проявлениями, характерными для токсоплазмоза.

Амебиаз. Возбудитель Entamoeba histolytica.

Серологическая диагностика позволяет подтвердить внекишечный амебиаз, при котором паразитологическая диагностика невозможна. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) обладает высоким диагностическим потенциалом при выявлении этой инфекции за счет высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости.

Определение специфических антител в РИФ с амебным антигеном имеет принципиальное значение для уточнения этиологии процесса с локализацией поражений в толстом кишечнике; при проведении дифференциальной диагностики заболеваний, клинически сходных с амебным абсцессом печени (ААП), особенно для больных, прибывших или вернувшихся из стран жаркого или тропического пояса. Серологические исследования особенно ценны при выявлении внекишечных форм амебиаза: 98 - 100% клинически выраженного ААП. Реакция иммунофлюоресценции дает положительный результат в 75 - 80% случаев инвазивного амебиаза кишечника, особенно при молниеносном колите, амебоме и перитоните. При интерпретации результатов РИФ следует учитывать, что титр 1:320 и выше свидетельствует, как правило, о клинически выраженной, чаще внекишечной форме амебиаза. В титре 1:80 - 1:160 реакция может быть положительной у больных амебиазом в момент обследования или переболевших в недавнем прошлом, а также в случае вялотекущих, стертых форм кишечного амебиаза. РИФ в титре 1:40 может быть положительна у лиц с симптомами кишечного амебиаза при соответствующем эпиданамнезе и неотягощенном статусе больного. В этом случае эффективно исследование парных сывороток, т.к. подъем уровня антител после лечения, безусловно, свидетельствует в пользу амебной этиологии процесса. Ложноположительный результат в титре 1:40 может быть зарегистрирован у больных с системным аутоиммунным и онкопроцессом (III - IV стадии). Реакция иммунофлюоресценции в низких титрах (1:20 - 1:40) позволяет выявить среди зараженных бессимптомных носителей возбудителя амебиаза. Последовательное неуклонное снижение у переболевших уровня антител ниже 1:20 - показатель эффективности лечения, в противном случае подъем титров и появление клинических симптомов следует оценивать как рецидив болезни.

При амебиазе реакция иммунофлюоресценции используется для подтверждения клинического диагноза, наблюдения за динамикой заболевания и последствий инфекции, вызванной дизентерийной амебой, при эпиднадзоре.

Отечественные тест-системы на амебиаз находятся в стадии разработки.

Лямблиоз. Возбудитель Lamblia intestinalis.

В настоящее время на лямблиоз предприятиями бакпрепаратов выпускаются отечественные диагностические тест-системы как экспериментальные для проведения иммуноферментного анализа сыворотки крови. Имеются зарубежные диагностические тест-системы, в т.ч. для определения лямблиозных антигенов в фекалиях.

Антитела к антигенам лямблий проявляются на 10 - 14 день после начала инвазии и присутствуют в крови и секретах человека практически на всех ее стадиях. Через 1 - 2 месяца после полной элиминации паразита концентрация специфичных IgG в крови человека резко снижается.

 

5. Основные принципы проведения серологических

методов исследования

 

5.1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

 

Иммунофлюоресцентный метод (непрямой вариант) представлен двухэтапной реакцией, при которой обнаружение искомого антитела в комплексе антиген - антитело (АГ - АТ) (1 этап) происходит с помощью конъюгата - антиглобулина, гомологичного по отношению к белкам иммунной сыворотки, меченного флюоресцеин-изотиоцианатом. Добавление конъюгата не обязательно для выявления комплекса АГ - АТ при наблюдении в люминесцентном микроскопе. В диагностический набор для РИФ входит: антигенный препарат (специально размеченные предметные стекла с зафиксированной на их поверхности взвеси корпускулярного антигена), контрольные положительная и отрицательная сыворотки, люминесцирующая антивидовая сыворотка и реагенты.

Принцип проведения реакции иммунофлюоресценции (непрямой вариант).

- Подготовка растворов.

- Титрование испытуемых сывороток и их контрольных образцов.

- Нанесение подготовленных разведений испытуемых и контрольных образцов сывороток на специально размеченные предметные стекла с антигеном.

- Инкубация препаратов с образцами во влажной камере (время и температура согласно инструкции).

- Отмывание препаратов в трех сменах фосфатно-солевого буфера (ФСБ) от непрореагировавших компонентов сыворотки.

- Высушивание препаратов на воздухе.

- Нанесение люминесцирующей антисыворотки (конъюгата) в рабочем разведении на стекла с антигеном.

- Инкубация препаратов во влажной камере при комнатной температуре.

- Отмывание препаратов в трех сменах ФСБ от непрореагировавших компонентов флюоресцирующей антисыворотки.

- Высушивание на воздухе.

- Нанесение препаратов на предметное стекло в забуференный глицерин под покровные стекла.

- Микроскопирование препаратов в люминесцентном микроскопе.

Результаты реакции оценивают по наличию и интенсивности поверхностного зеленовато-желтого свечения клеток антигена по 4-балльной системе:

- 3 - 4 креста - яркая флюоресценция зеленого цвета по периферии клетки токсоплазм, четко контрастирующая с телом клетки;

- 2 креста - слабое, но явно зеленое свечение периферии клетки;

- 1 крест - очень слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с телом клетки.

Отсутствие свечения клеток и их границ "ободка" в отрицательном контроле при ярком флюоресцировании "ободка" клеток, обработанных положительной контрольной сывороткой, подтверждает надежность проводимого исследования.

За титр реакции принимают то разведение сыворотки, в котором 50% и более клеток антигена в каждом изученном поле зрения имеют четкое специфическое поверхностное свечение. Значение диагностического титра - 1/80 - 1/100.

 

5.2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

 

Реакция непрямой гемагглютинации основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности антиген и при контакте со специфическими антителами склеиваться и образовывать осадок, видимый невооруженным глазом.

Она рекомендуется для диагностики описторхоза в острой фазе, трихинеллеза и эхинококкоза в острой и хронической фазах заболевания рекомендуется РНГА. Метод обладает высокой чувствительностью (до 90 - 98%) в острой фазе описторхоза, трихинеллеза и хронической - трихинеллеза и эхинококкоза. В хронической фазе описторхоза чувствительность РНГА не превышает 45%.

Реакцию непрямой гемагглютинации можно использовать в качестве теста, дополняющего результаты иммуноферментного анализа, для повышения достоверности серологической диагностики гельминтозов.

Диагностический набор содержит: формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные специфическим антигеном (Д+), эритроциты барана без антигена (Д-), сыворотку диагностическую агглютинирующую, положительный контрольный тест (К+), сыворотку нормальную человека - отрицательный контрольный тест (К-), эритроциты барана сухие (Э), реагент для приготовления раствора для разведения сывороток.

5.2.1. Принцип постановки РНГА

Проведение реакции непрямой гемагглютинации с использованием промышленных препаратов включает следующие этапы, которые должны точно соответствовать инструкции по применению используемого препарата:

1) подготовка растворов, необходимых для проведения анализа;

2) подготовка испытуемых сывороток и контрольных сывороточных образцов;

3) нанесение на планшет испытуемых и контрольных образцов;

4) внесение диагностикума (Д+) и эритроцитов без антигена (Д-);

5) инкубация;

6) учет результатов.

Результаты анализа учитываются в титрах и по интенсивности реакции, выраженной в крестах. При оценке результата реакции по 4-крестной системе учитывается характер осадка эритроцитов на дне лунок:

- резко интенсивная реакция (++++) - все эритроциты агглютинированы и покрывают дно лунок, образуя "зонтик";

- интенсивная реакция (+++) - агглютинированы почти все эритроциты, образуя зонтик, в центре которого имеется заметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов;

- реакция средней интенсивности (++) - на дне лунки различается осадок из неагглютинированных эритроцитов в виде плотного широкого кольца;

- реакция слабой интенсивности (+) - мелкие агглютинаты на дне лунки, большинство эритроцитов не агглютинировало и осело в центре лунки в виде маленького кольца;

- реакция отрицательная (-) - эритроциты осели на дне лунки, образуя "пуговку" или маленькое колечко с ровными краями.

Учет проводится при соответствующих показателях контролей:

Д+ - не образует спонтанной агглютинации в отсутствии сывороток, с К- - не агглютинируют в разведении выше диагностического титра, с К+ - агглютинируют (см. инструкцию по применению);

Д- - не образуют спонтанной агглютинации в отсутствии сыворотки, а также с К+ и испытуемыми сыворотками.

Титром сыворотки считают последнее разведение, при котором наблюдается четкая агглютинация не менее чем на 3 креста (+++). Диагностические титры реакции с эритроцитарными диагностикумами указаны в инструкции по применению.

 

5.3. Иммуноферментный анализ (ИФА)

 

Реакция иммуноферментного анализа (ИФА) основана на специфическом взаимодействии антигена и антитела с предварительной иммобилизацией (фиксацией) одного из компонентов реакции (антигена или антител) на твердофазном носителе (в лунках полистироловых планшетов, стрипов и др.) и выявлении образовавшегося комплекса АГ - АТ посредством ферментной метки (конъюгат). Выявление образовавшегося комплекса осуществляется по изменению интенсивности окраски (оптической плотности) субстратной смеси, содержащей вещество, с которым реагирует фермент, и индикатор, изменяющий цвет под действием продуктов реакции фермент - субстрат.

Реакция ИФА обладает рядом преимуществ перед другими серологическими тестами, которые состоят в следующем:

- высокой специфичности и чувствительности;

- возможности использования универсальных реагентов и отконтролированных диагностических тест-систем; высокая стабильность реагентов (не менее 6 месяцев);

- возможность стандартизации проведения анализа и учета его результатов за счет автоматизации процесса.

В используемых в медицинской практике на территории России тест-системах ИФА участвует 3 компонента: антиген паразита, специфические антитела исследуемой сыворотки крови и конъюгат (меченные ферментом антивидовые антитела или протеин А стафилококка).

Реакцию АГ - АТ с конъюгатом выявляют путем введения в состав субстратной смеси одного из хромогенов: ортофенилендиамина (ОФД), 5-аминосалицидовой кислоты (5-АС) или тетраметилбензидин (ТМБ).

Учет результатов при использовании 5-АС и ОФД проводят по оптической плотности при длине волны 492 нм, а при использовании ТМБ - при 450 нм на сканирующем спектрофотометре типа "Мультискан", "Униплан", "Биоскрин", "Стат-Факс" и т.п. При отсутствии прибора автоматического измерения оптической плотности возможен визуальный учет результатов анализа по интенсивности цветовой окраски раствора в тех случаях, когда это предусмотрено инструкцией по применению.

Диагностический набор (тест-система) включает:

- твердофазный носитель с адсорбированным на нем специфическим антигеном паразита;

- контрольные тест-сыворотки (диагностические, отрицательные и положительные) для определения правильности хода реакции и оценки результатов анализа;

- основные ингредиенты для приготовления растворов, используемых в ходе реакции.

5.3.1. Подготовка к работе

Режим работы лаборатории, выполняющей серологические исследования на паразитарные заболевания, должен соответствовать СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

Все исследуемые образцы сывороток крови следует считать потенциально инфицированными, независимо от результатов тестов, которые провел производитель тест-системы.

5.3.2. Подготовка проб исследуемых сывороток

Подготовку сыворотки крови проводить в соответствии с п. 3 (пп. 3.2). Сыворотку во избежание гемолиза крови следует отбирать не позже чем через 2 ч после взятия крови. Тест-системы отечественного производства и некоторые импортные наборы чувствительны к наличию гемолиза в пробе и вследствие этого могут давать ложноположительные результаты. При приготовлении сывороток должны быть приняты все меры, позволяющие исключить их контаминацию.

5.3.3. Принцип постановки ИФА

Проведение иммуноферментного анализа с использованием промышленных диагностических препаратов включает следующие этапы, которые должны точно соответствовать инструкции по применению используемого препарата:

1. Подготовка растворов, необходимых для проведения анализа

- Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ), состоящий из солей и твина. Этот раствор используется как отмывающий в ходе реакции и для приготовления раствора для разведения сывороток. Состав солей и навески для приготовления раствора ФСБ определены в инструкции. В большинстве тест-систем раствор ФСБ прилагается в концентрированном виде, и для приготовления рабочего раствора требуется только разведение дистиллированной водой до объема, указанного в инструкции.

- Раствор для разведения контрольных и испытуемых сывороток готовится на рабочем растворе ФСБ (см. инструкцию по применению).

Разведение всех ингредиентов (сыворотка, конъюгат, субстратная смесь и др.) и объемы их внесения в планшет должны соответствовать инструкции по применению.

2. Подготовка испытуемых сывороток и контрольных образцов

- Если тест-система укомплектована контрольными сыворотками в рабочем разведении, то они не требуют дополнительных разведений. При укомплектации тест-систем контрольными сыворотками (отрицательной, положительной, диагностической) в сухом виде или исходными растворами - необходимо приготовить рабочие разведения, в концентрациях, указанных в инструкции или непосредственно на флаконах.

Подготовленные испытуемые сыворотки разводят раствором для разведения сывороток в отдельных планшетах. Нельзя применять для предварительного разведения сывороток неиспользованные планшеты из наборов с сорбированными антигенами или антителами. Разведенные сыворотки хранению не подлежат.

Для получения рабочих разведений в соотношениях, которые указываются в инструкции, например: 1:100 или 1:200, т.е. к 100 или, во втором случае к 200 частям раствора для разведения сыворотки добавляется 1 часть нативной сыворотки обследуемого.

Если сыворотки испытуемой или контрольной взяли объем, равный 0,01 мл, то при разведении 1:100 необходимо взять 1 мл раствора для разведения сыворотки (0,01 мл х 100 частей = 1,0 мл), а при разведении 1:200 необходимо взять 2 мл раствора для разведения сыворотки (0,01 мл х 200 частей = 2 мл).

Приготовление рабочих растворов контрольных сывороток

тест-ситемы (К+, К-, К) требуется только в тест-системах, где это

д

указано в инструкции.

Следует учитывать, что сыворотки и типичные разводящие растворы для сывороток могут различаться по плотности и вязкости. Поэтому при приготовлении разведений их следует тщательно перемешать пипетированием.

3. Нанесение на планшет испытуемых и контрольных образцов

При скрининге сыворотки исследуют в одном диагностическом разведении, внося их во все лунки планшета, кроме одной (контроль конъюгата).

Следует