МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ 8 страница3. Приготовление 80%-ного раствора ТХУ (см. раздел 14.1.1). 4. Приготовление 1 моль/л раствора натрия гидроксида. 40 г гранулированной щелочи растворяют в 500 мл воды и после охлаждения до комнатной температуры доводят общий объем раствора до 1 л. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр N 2 и хранят в склянке, закрытой пробкой с хлоркальциевой трубкой. 5. Приготовление реактива Фолина (раздел 17.1). Возможно использование коммерческого реактива Фолина. 6. Приготовление стандартного раствора тирозина в концентрации 0,01%. 5 мг тирозина растворяют в растворе 4,5% ТХУ в мерной колбе, вместимостью 50 мл, и объем доводят этой же кислотой до метки. 7. Требование к тирозину. Показатель оптической плотности 0,01% раствора тирозина в 5 моль/л соляной кислоте должен быть 0,66 при длине волны 280 нм и 0,35 при длине волны 260 нм.
29. Определение примеси протеолитических ферментов в иммуноглобулинах
Метод основан на расщеплении пептидных связей субстрата протеолитическими ферментами, присутствующими в качестве примеси в препаратах иммуноглобулина. Протеолитическую активность фермента выражают количеством тирозина, освобождающегося под действием ферментов. Методика определения. К 1 мл препарата иммуноглобулина добавляют 1 мл денатурированного гемоглобина (субстрат). Одновременно готовят контрольные пробы: на субстрат K1 - 1 мл гемоглобина и 1 мл фосфатного буферного раствора pH 7,2; на иммуноглобулин K2 - 1 мл иммуноглобулина и 1 мл фосфатного буферного раствора pH 7,2. Все пробы выдерживают при 37 °С в водяном термостате в течение 24 ч. Затем проводят осаждение белка 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ), добавляя его в количестве 2,5 мл. Одновременно проводят осаждение белка в контрольной пробе К: 1 мл препарата иммуноглобулина, 1 мл денатурированного гемоглобина и 2,5 мл 5%-ного раствора ТХУ. Все пробы центрифугируют при 2000 об./мин. в течение 30 мин. при 5 °С. Надосадочную жидкость фильтруют через ватный тампон. К 1 мл фильтрата добавляют 2 мл 0,5 моль/л раствора натрия гидроксида и 1 мл реактива Фолина в разведении 1:3, перемешивают и через 30 мин. измеряют оптическую плотность проб на спектрофотометре при длине волны 750 нм против контрольной пробы К. Калибровочный график. Готовят стандартный раствор тирозина в концентрации 1 мг/мл (50 мг тирозина растворяют в мерной колбе, вместимостью 50 мл). 0,05, 0,1 - 0,6 мл стандартного раствора с интервалом 0,1 мл помещают в пробирки. Объем проб доводят раствором ТХУ (0,2 моль/л) до 1 мл, затем добавляют 2 мл 0,5 моль/л раствора натрия гидроксида и 1 мл реактива Фолина в разведении 1:3. Оптическую плотность испытуемых проб измеряют против контрольной пробы, содержащей все вышеуказанные реактивы, кроме стандартного раствора. Рассчитывают количество тирозина в микрограммах на 1 мл иммуноглобулина (X) по формуле:
X = (а - (К1 + К2)) x 4,5,
где: а - количество тирозина в опытной пробе, найденное по калибровочному графику, мкг; К1, К2 - количество тирозина в контрольных пробах К1 и К2; 4,5 - общий объем проб после добавления ТХУ. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс количество тирозина (мкг), а на оси ординат - соответствующие им величины оптической плотности. Примечания. 1. Приготовление фосфатного буферного раствора pH 7,2. 1,250 г Na2HPO4 x 2H2O и 0,40 г KН2РO4 растворяют в дистиллированной воде и объем доводят водой до 1 л. 2. Приготовление денатурированного гемоглобина. 800 мг лиофильно высушенного гемоглобина растворяют в 10 мл 8 моль/л раствора мочевины. Выдерживают в течение 2 ч при 60 °С на водяной бане. Раствор мочевины после охлаждения разводят в 4 раза фосфатным буферным раствором pH 7,2. 3. Приготовление реактива Фолина (раздел 17.1).
30. Определение содержания бычьего сывороточного альбумина методом ракетного иммуноэлектрофореза
Метод основан на способности антигена мигрировать в электрическом поле в гель, содержащий антисыворотку, в результате чего происходит реакция преципитации. Линия преципитации образует пик (ракету), высота которого пропорциональна концентрации внесенного антигена. Методика предназначена для определения концентрации бычьего сывороточного альбумина (БСА) в диапазоне 0,5 - 2,0 мкг/мл. Методика определения. В химическую пробирку с 16 мл расплавленного и охлажденного до температуры 56 °С 1%-ного геля агарозы вносят 16 мкл сыворотки против БСА с титром 1:1000 (или 32 мкл сыворотки с титром 1:500) и перемешивают. Содержимое пробирки выливают на стеклянную пластинку, установленную на горизонтальной поверхности. Пластина должна покрыться агарозовым гелем равномерно и полностью, толщина геля (1,0 +/- 0,1) мм. После застывания геля агарозы пластинку накладывают на трафарет (рис. 2 - не приводится) и пробивают лунки пробойником диаметром 4 мм. Гель из лунок удаляют с помощью вакуумного насоса или иглы. Помещают пластинку в прибор для электрофореза ПЭФ-3. В камеры прибора наливают 1,5 л электродного буферного раствора. Соединяют поверхность агарозы с буферным раствором с помощью фитилей (5 слоев фильтровальной бумаги размером 120 x 60 мм или 1 слой бумаги "Ватман 3М"). Расстояние от края фитиля до лунок должно быть не менее 15 мм. В лунки микрошприцем или автоматической пипеткой вносят по 15 мкл растворов БСА для калибровочного графика и испытуемые пробы. Каждую пробу вносят в 2 лунки. Время от начала нанесения образцов до включения прибора в сеть не должно превышать 10 мин. Включают прибор в сеть и проводят электрофорез при напряжении 6 - 8 В на 1 см длины геля и силе тока 6 мА в течение 18 - 20 ч. По окончании электрофореза пластинку переносят в кювету с 0,9%-ным раствором натрия хлорида и промывают, дважды меняя этот раствор. Пластинку вынимают, накрывают фильтровальной бумагой, прокалывают иглой бумагу над лунками и высушивают при температуре 18 - 20 °С. Пластинку с высушенным гелем переносят в кювету с красителем на 15 - 20 мин., затем в кювету с раствором для обесцвечивания окрашенных гелей на 1 - 3 мин., далее промывают в водопроводной воде и высушивают при температуре 18 - 20 °С. Измеряют высоту пика (h) с помощью линейки. Измерение делают от края лунки до внешнего края пика (рис. 3 - не приводится). Концентрацию БСА в испытуемой пробе определяют по калибровочному графику, который воспроизводят при каждом анализе. Калибровочный график должен проходить через начало координат. Калибровочный график. ОСО содержания бычьего альбумина разводят в соответствии с инструкцией по применению до концентрации 2,0 мкг/мл. К 0,1; 0,2; 0,3 мл полученного раствора прибавляют воду соответственно до 0,4 мл (БСА - 0,5; 1,0 и 1,5 мкг/мл). Для построения калибровочного графика используют растворы БСА концентрации 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мкг/мл. Растворы хранят не более 2 суток при температуре 4 - 8 °С. Примечания. 1. Получение сыворотки против бычьего сывороточного альбумина (сыворотка против БСА). Кроликов породы Шиншилла, массой 2,5 - 3,5 кг, иммунизируют 0,15%-ным раствором БСА. Используют БСА любой марки с содержанием белка не менее 95%. Раствор БСА готовят на 0,9%-ном растворе натрия хлорида. I цикл иммунизации состоит из двух инъекций раствора БСА с интервалом 7 сут. в дозе 1,0 мл в смеси с 1,0 мл адъюванта Фрейнда в область подколенных лимфатических узлов (последовательно в правую и левую, или наоборот). II цикл иммунизации проводится через 30 сут. после 1 цикла и состоит из пяти внутрибрюшинных инъекций с интервалом 2 сут. в возрастающих дозах - 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 мл (за 1 ч до первой инъекции проводится десенсибилизация - 0,1 мл раствора БСА подкожно). III цикл иммунизации проводится через 30 сут. после II цикла иммунизации и состоит из трех внутривенных инъекций с интервалом 2 сут. в возрастающих объемах - 0,5; 1,0; 1,5 мл раствора БСА (за 1 ч до первой инъекции проводится десенсибилизация - 0,1 мл раствора БСА подкожно). Через 7 сут. после последней иммунизации у кроликов берут 2 - 3 мл крови и в сыворотке определяют титр антител против БСА методом ракетного иммуноэлектрофореза (разведение сыворотки, дающее пик высотой не менее 1 мм с раствором БСА в концентрации 0,5 мкг/мл). Сыворотка, имеющая титр не ниже 1:500, годна к дальнейшему использованию, в этом случае кроликов обескровливают тотально. Если титр сыворотки ниже 1:500, через 30 сут. проводят IV цикл иммунизации (аналогичный III циклу), через 7 сут. кроликов обескровливают тотально и устанавливают титр антител против БСА. Сыворотка, имеющая титр ниже 1:500, подлежит уничтожению. При обескровливании кроликов кровь от каждого из них собирают в отдельный флакон. Флаконы с кровью ставят в термостат при температуре (37 +/- 1) °С на 60 - 65 мин., затем обводят образовавшийся сгусток пастеровской пипеткой и оставляют при температуре 4 - 8 °С на 18 - 20 ч, затем сыворотку отсасывают в стерильную посуду, прибавляют борную кислоту из расчета 20 - 25 мг на 100 мл сыворотки и разливают по 0,5 мл в ампулы из стекла НС-1, ампулы запаивают и хранят при температуре минус (20 +/- 1) °С в течение 2-х лет. 2. Приготовление концентрированного трис-боратного буферного раствора с трилоном Б (pH 8,6 - 8,8). 60,5 г трис-(оксиметил)-амнометана, 6,0 г трилона Б, 19,0 г борной кислоты последовательно растворяют в воде и доводят объем водой до 1 литра в мерном цилиндре. При необходимости раствор фильтруют через бумажный фильтр. 3. Приготовление электродного буферного раствора (pH 8,6 - 8,8). Концентрированный трис-боратный буферный раствор с трилоном Б (pH 8,6 - 8,8) разводят водой в 6 раз. Используют не более 4 раз. 4. Приготовление 1%-ного геля агарозы. 1 г агарозы помещают в колбу, вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл воды и растворяют при нагревании на кипящей водяной бане, прибавляют 20 мл концентрированного трис-боратного буферного раствора с трилоном Б и вновь нагревают на кипящей водяной бане 30 мин. Разливают по 16 мл в пробирки. Хранят при температуре 4 - 8 °С не более 2-х месяцев. 5. Приготовление красителя. 0,30 г Кумасси бриллиантового голубого R-250 растворяют в 100 мл раствора, применяемого для обесцвечивания окрашенных гелей, и затем фильтруют. 6. Приготовление раствора для обесцвечивания окрашенных гелей. К 200 мл ледяной уксусной кислоты прибавляют 500 мл этилового спирта и 300 мл воды. 7. Подготовка стеклянных пластинок. На стеклянные пластинки размером 120 x 90 мм, обработанные хромовой смесью, наносят одну каплю расплавленного 1%-ного геля агарозы, растирают ее по поверхности пластинки с помощью пипетки и подсушивают.
31. Определение фенола
31.1. Метод определения фенола с реактивом Фолина Метод основан на свойстве реактива Фолина давать цветную реакцию с фенолом. Методика определения. 0,5 мл препарата помещают в мерную колбу, вместимостью 50 мл, и доводят объем раствора водой до метки. К 0,5 мл полученного раствора прибавляют 9,5 мл воды и 0,5 мл реактива Фолина, содержимое перемешивают. Прибавляют 2 мл 20%-ного раствора натрия карбоната, перемешивают, затем пробу помещают в кипящую водяную баню на 1 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 310 нм по сравнению с контрольной пробой, содержащей 10 мл воды, 0,5 мл реактива Фолина, 2 мл 20%-ного раствора натрия карбоната. Содержание фенола в препарате вычисляют по калибровочному графику. Калибровочный график. 0,5 г (точная навеска) фенола растворяют в воде в мерной колбе, вместимостью 50 мл, и доводят объем раствора водой до метки (10 мг/мл фенола). Полученный раствор хранят в склянке из темного стекла при температуре 4 - 8 °С в течение года. Перед употреблением 1 мл раствора разводят водой в 100 раз (100 мкг/мл фенола). К 0,05 - 0,25 мл полученного раствора (5 - 25 мкг фенола), взятого микропипеткой с интервалом 0,05 мл, прибавляют воду до 10 мл, реактивы перемешивают и проводят анализ, как указано выше. Примечание. Приготовление реактива Фолина. Метод изложен в разделе "Определение белка по методу Лоури" 17.1.
31.2. Спектрофотометрический метод Метод основан на способности фенола поглощать ультрафиолетовый свет и заключается в измерении оптической плотности растворов при длинах волн 269 нм и 290 нм с последующим определением содержания фенола по калибровочному графику. Метод может быть применен для препаратов с содержанием белкового азота не более 0,5 мг/мл. Методика определения. 0,5 мл препарата помещают в мерную колбу, вместимостью 50 мл, и доводят объем раствора водой до метки. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длинах волн 269 и 290 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, которым является вода. Находят разность между первым и вторым показателем и по калибровочному графику определяют концентрацию фенола в разведенном препарате. Концентрацию фенола в исходном препарате в процентах (X) вычисляют по формуле:
а x 100 x 100 а X = ------------- = ---, 1000000 100
где a - количество фенола на 1 мл, найденное по калибровочному графику, мкг. Калибровочный график. Готовят раствор фенола с концентрацией 10 мг/мл, как указано в разделе 31.1. Перед определением раствор фенола разводят водой в 100 раз (100 мкг/мл). К 0,5 - 2,5 мл полученного раствора с интервалом 0,5 мл прибавляют воду до объема 5 мл (концентрация фенола 10 - 50 мкг/мл) и измеряют оптическую плотность, как указано выше.
32. Определение формальдегида
Метод основан на образовании хиноидного красителя при взаимодействии фуксинсернистого реактива с водно-растворимыми альдегидами. Методика определения. Необходимый объем препарата (0,5; 1,0 или 2,0 мл) с концентрацией формальдегида 20 - 80 мкг/мл помещают в пробирку, доводят объем раствора водой до 5 мл, прибавляют 1 мл раствора фуксинсернистой кислоты, перемешивают, пробирки закрывают резиновыми пробками и оставляют на 1 ч. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 590 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольной пробой, содержащей 5 мл воды и 1 мл раствора фуксинсернистой кислоты. Содержание формальдегида в препарате в микрограммах на 1 мл (X) вычисляют по формуле:
а X = -, А
где: а - концентрация формальдегида на 1 мл, рассчитанная по калибровочному графику, мкг; А - количество анализируемого препарата, мл. При наличии опалесценции в препарате производят визуальное определение путем сравнения окраски препарата с образцом с известной концентрацией формальдегида. Сравнение проводят на фоне белой бумаги. Калибровочный график. Готовят основной раствор формальдегида (концентрация формальдегида около 4 мг/мл): 1,0 мл формалина помещают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, и доводят объем раствора водой до метки. Определяют содержание формальдегида в основном растворе. Основной раствор хранят не более 1 мес. Перед употреблением из основного раствора готовят рабочий раствор с концентрацией формальдегида 20 мкг/мл. Например, содержание формальдегида в основном растворе 4,4 мг/мл, 0,45 мл такого раствора помещают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, и доводят объем водой до метки. К 1,0 - 4,0 мл рабочего раствора с интервалом 0,5 мл (концентрация формальдегида в пробах 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 мкг/мл) прибавляют воду до объема 5 мл и 1 мл раствора фуксинсернистой кислоты, далее анализ проводят, как описано выше. Примечания. 1. Приготовление раствора фуксинсернистой кислоты. 1 г фуксина основного или парафуксина для фуксинсернистой кислоты растворяют в 500 мл воды на кипящей водяной бане. Раствор охлаждают до температуры 18 - 20 °С, фильтруют в мерную колбу, вместимостью 1 л, и прибавляют 30 мл 20%-ного раствора калия пиросернистокислого (или 25 мл 20%-ного раствора натрия пиросернистокислого), через 20 мин. к смеси прибавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты, доводят объем раствора водой до метки и выдерживают не менее суток. Перед использованием раствора фуксинсернистой кислоты его титруют раствором йода концентрации 0,05 моль/л (индикатор - 0,5%-ный раствор крахмала). На титрование 3 мл фуксинсернистой кислоты должно расходоваться от 3 до 4 мл раствора йода. Если объем раствора йода, израсходованного на титрование, меньше 3 мл, то к 100 мл приготовленного реактива прибавляют калий (или натрий) пиросернистокислый из расчета 200 мг на каждый миллилитр разницы между 3 мл и израсходованным объемом раствора йода. Если объем раствора йода, израсходованного на титрование, больше 4 мл, то к 100 мл реактива прибавляют раствор фуксина основного или парафуксина (Vl) в количестве, рассчитываемом по формуле:
V + 100 Vl = -------,
где: V - объем раствора йода концентрации 0,05 моль/л, израсходованного на титрование 3 мл реактива, мл; 100 - объем фуксинсернистой кислоты, мл; 27 - коэффициент пересчета. Приготовленный реактив применяется не раньше чем через сутки. Реактив должен быть бесцветным, допускается слегка желтоватая окраска. Для осветления раствора допускается применение активированного угля. Реактивы хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой. 2. Приготовление раствора фуксина. 1 г фуксина основного или парафуксина для фуксинсернистой кислоты растворяют в 500 мл воды на кипящей водяной бане. Раствор охлаждают до температуры 18 - 20 °С и фильтруют. 3. Количественное определение формальдегида в основном растворе. 5 мл основного раствора формальдегида помещают в колбу с притертой пробкой, прибавляют 20 мл раствора йода концентрации 0,05 моль/л и 10 мл раствора натрия гидроксида концентрации 1 моль/л, перемешивают и оставляют в темном месте на 10 мин. Затем прибавляют 11 мл раствора серной кислоты концентрации 0,5 моль/л, выделившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата концентрации 0,05 моль/л (индикатор - 0,5%-ный раствор крахмала). 1 мл раствора йода концентрации 0,05 моль/л соответствует 0,001501 г формальдегида, которого в препарате должно быть не менее 36% и не более 40%. Если содержание формальдегида в препарате меньше 40%, то для приготовления раствора, содержащего 4 мг/мл формальдегида, производят соответствующий перерасчет.
Содержание формальдегида в процентах (X) вычисляют по формуле:
(а - б) x к x 0,001501 x 100 x 100 X = ----------------------------------, 5,0
где: а - количество раствора натрия тиосульфата концентрации 0,05 моль/л, использованное на титрование контрольного раствора, мл; б - количество раствора натрия тиосульфата концентрации 0,05 моль/л, использованное на титрование испытуемого препарата, мл; к - поправка к титру раствора натрия тиосульфата концентрации 0,05 моль/л; 0,001501 - количество формальдегида, соответствующее 1 мл раствора йода концентрации 0,05 моль/л, г; 5,0 - объем препарата, мл; 100 - разведение препарата; 100 - коэффициент пересчета в проценты. Содержание формальдегида в основном растворе формальдегида проверяют по вышеуказанной методике не реже 1 раза в месяц.
33. Определение мертиолята
33.1. Колориметрический метод Метод основан на выделении из мертиолята ртути в виде свободных ионов и последующем колориметрическом определении дитизоната ртути. Методика определения. 0,2 мл препарат вносят в колбу с притертой пробкой, вместимостью 100 мл, прибавляют 1,2 мл разведенной по объему в 2 раза концентрированной серной кислоты (при наличии алюминия гидроокиси в препарате смесь осторожно нагревают на водяной бане до полного ее растворения), 5 мл 5%-ного раствора калия перманганата, хорошо перемешивают и оставляют на один час. Избыток калия перманганата удаляют добавлением 1,5 мл 20%-ного раствора сульфата гидроксиламина, прибавляют 30 мл воды, 5 мл раствора уксусной кислоты концентрации 6 моль/л и перемешивают. К полученному раствору из бюретки прибавляют 10 мл 0,001%-ного раствора дитизона и встряхивают 30 с. Содержимое колбы переносят в делительную воронку и после разделения слоев нижний хлороформный слой фильтруют через предварительно прокипяченную и высушенную вату в кювету с толщиной слоя 20 мм. Определяют оптическую плотность хлороформного раствора на фотоэлектроколориметре типа КФК-3 при длине волны 597 нм. Одновременно по этой же методике готовят контрольный раствор, содержащий все вышеперечисленные компоненты, кроме испытуемого препарата. На основании оптической плотности, измеренной по сравнению с контрольным раствором, по калибровочному графику находят содержание ртути в испытуемом растворе. Содержание мертиолята в растворе в микрограммах на 1 мл (Х) вычисляют по формуле:
а x 100 X = ----------- = а x 10,1, 0,2 x 49,55
где: а - количество ртути, найденное по калибровочному графику, мкг; 0,2 - количество испытуемого препарата, мл; 49,55 - содержание ртути в 100 частях мертиолята. Калибровочный график. 0,5 г металлической ртути (точная навеска) помещают в мерную колбу, вместимостью 500 мл, и растворяют в 15 мл концентрированной азотной кислоты и доводят объем раствора до метки (1 мг/мл). Определяют содержание ртути. Перед употреблением раствор разводят водой в 100 раз. К 0,4 - 1,2 мл полученного раствора (4 - 12 мкг ртути) с интервалом 0,2 мл прибавляют по 1,2 мл разведенной по объему в два раза концентрированной серной кислоты, 30 мл воды, 5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида, 5 мл раствора уксусной кислоты концентрации 6 моль/л, далее проводят анализ, как в опытной пробе. Калибровочный график воспроизводят перед каждым определением. Примечания. 1. Приготовление 0,001%-ного раствора дитизона. 10 мг дитизона (точная навеска) помещают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, растворяют в хлороформе и доводят объем раствора до 100 мл. Раствор хранят в темном месте при температуре 4 - 8 °С в течение месяца. Перед употреблением раствор разводят в 10 раз. В целях стандартизации условий определения рекомендуется измерять оптическую плотность полученного раствора на фотоэлектроколориметре, контрольной пробой при этом служит вода. Колебания оптической плотности 0,001%-ного раствора дитизона от опыта к опыту не должны превышать +/- 0,25 оптических единиц. 2. Определение содержания ртути. К 10 мл раствора (с концентрацией ртути 1 мг/мл) прибавляют 10 капель 10%-ного раствора железоаммонийных квасцов и медленно титруют раствором аммония роданида концентрации 0,01 моль/л до изменения окраски в оранжевый цвет. 1,0 мл раствора аммония роданида концентрации 0,01 моль/л соответствуют 0,001003 г ртути.
33.2. Полярографический метод Метод основан на полярографической активности мертиолята. Методика определения. К 4,5 мл испытуемого препарата прибавляют 0,5 мл раствора калия хлорида концентрации 2 моль/л. Пробу помещают в электролизер, термостатируемый при температуре (20 +/- 1) °С. Через испытуемый раствор пропускают в течение 10 - 15 мин. газообразный азот. Ртутный капельный электрод опускают в электролизер и снимают полярограмму на полярографе с регистрирующим устройством в области потенциала от 0,2 до 1,0 В (внутренний анод). Содержание мертиолята в препарате в микрограммах на 1 мл (Х) рассчитывают по формуле:
а x 5,0 X = ------- x 1,1 x а, 4,5
где: а - концентрация мертиолята в анализируемой пробе, рассчитанная по калибровочному графику, мкг/мл; 5,0 - общий объем пробы, мл; 4,5 - количество испытуемого препарата в пробе, мл. Калибровочный график. 1,5 г мертиолята (точная навеска) помещают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки. Раствор хранят при температуре 4 - 8 °С в течение 3 мес. Перед определением раствор разводят в 100 раз. К 1,0 - 4,5 мл полученного раствора (содержание ртути 30 - 150 мкг/мл) с интервалом в 0,5 мл прибавляют 0,5 мл раствора хлорида калия концентрации 2 моль/л, доводят общий объем до 5 мл и проводят анализ, как описано выше. На полученных полярограммах измеряют высоту волны и строят калибровочный график, на оси ординат которого откладывают значение высоты волны (среднее 3-х определений), а на оси абсцисс - соответствующие значения концентрации мертиолята в микрограммах на миллилитр. Калибровочный график пригоден неограниченное время для данного капилляра при постоянных условиях определения (температура, время каплеобразования). Мертиолят, используемый для приготовления стандартного раствора, должен соответствовать требованиям, перечисленным ниже. Методы оценки качества мертиолята Мертиолят (тиомерсал)
о-этилртутьтиосалицилат натрия М.м. 404,8 C9H9HgNaO2S
Описание. Легкий кремоватый кристаллический порошок со слабым характерным запахом. Растворимость. 1 г препарата без остатка растворяется при температуре 18 - 22 °С в 1 г воды, а также в 35 мл спирта. Раствор должен быть бесцветным или светло-желтым. Препарат почти нерастворим в бензоле и эфире. Концентрация водородных ионов (pH) 6,0 - 8,0. Используют 1%-ный раствор на свежепрокипяченной воде. Определение проводят потенциометрически. Подлинность. 0,05 г препарата растворяют в 5,0 мл воды. К раствору прибавляют 1,0 мл 10%-ного раствора серебра нитрата. Образуется белый осадок. 0,05 г препарата растворяют в 5,0 мл воды. К раствору прибавляют 1,0 мл 10%-ного раствора меди сульфата. Образуется осадок зеленого цвета. 0,5 г препарата растворяют в 10 мл воды и прибавляют 2,0 мл раствора соляной кислоты концентрации 2 моль/л. Выделившийся белый осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают водой до исчезновения хлорид-ионов. Осадок, высушенный в присутствии фосфора (V) оксида при давлении не более 0,667 кПа (5,0 мм рт. ст.) до постоянной массы, имеет температуру плавления 110 °С. Ртутные соли. 0,1 г препарата растворяют в 5,0 мл воды. К раствору прибавляют 1,0 мл 5%-ного свежеприготовленного раствора натрия сульфида. Выпавший белый осадок не должен изменять цвета при выдерживании в темном месте в течение 30 мин. Растворимые в эфире вещества. 0,5 г препарата (точная навеска) встряхивают с 20,0 мл эфира в течение 10 мин, фильтруют. После испарения эфира остаток, высушенный в течение 22 - 24 ч в присутствии фосфора (V) оксида при давлении не более 0,667 кПа (5,0 мм рт. ст.), должен весить не более 4,0 мг. Потеря в массе при высушивании. 0,5 г препарата высушивают в течение 24 ч в присутствии фосфора (V) оксида при давлении не более 0,667 кПа (5,0 мм рт. ст.). Потеря в массе при высушивании не должна превышать 0,5%. Количественное определение. 0,3 г препарата (точная навеска) растворяют в 10,0 мл воды, прибавляют 1,5 г растертого калия перманганата и хорошо перемешивают. Через 5 мин. в колбу осторожно прибавляют при постоянном перемешивании по каплям 5 мл концентрированной серной кислоты. Через 5 - 10 мин. выделившийся осадок растворяют при постепенном прибавлении 4,0 - 8,0 мл 3%-ного раствора перекиси водорода. К обесцвеченному раствору прибавляют по каплям 5%-ный раствор калия перманганата до неисчезающего розового окрашивания. Раствор вновь обесцвечивают добавлением по каплям 4%-ного раствора щавелевой кислоты. Полученный раствор после прибавления 5,0 мл 10%-ного раствора железоаммонийных квасцов медленно титруют раствором аммония роданида концентрации 0,1 моль/л до изменения окраски. 1,0 мл раствора аммония роданида концентрации 0,1 моль/л соответствует 0,02024 г мертиолята. Высушенный в присутствии фосфора (V) оксида препарат должен содержать не менее 98% и не более 101% мертиолята. Хранение. Яд! Хранят в банке с притертой пробкой, в защищенном от света месте. Препарат подвергают переконтролю 1 раз в 3 мес. Если мертиолят не соответствует одному из перечисленных требований, его бракуют.
34. Определение гидроксиламина
Метод основан на получении окрашенного продукта взаимодействия гидроксиламина и альфа-нафтиламина. Метод рекомендован для препаратов, представляющих собой антигенные комплексы, полученные с применением гидроксиламина (протейная, клебсиеллезная, дизентерийные вакцины). Методика определения. К 1 мл препарата прибавляют 0,5 мл 20%-ного раствора натрия ацетата и при постоянном помешивании вносят последовательно 0,5 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты, 0,15 мл 1,3%-ного раствора йода, 0,5 мл 1,6%-ного раствора натрия тиосульфата. После обесцвечивания раствора прибавляют 0,3 мл 0,3%-ного раствора альфа-нафтиламина. При наличии гидроксиламина появляется красное окрашивание. Определяют оптическую плотность окрашенного раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм и кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольной пробой, состоящей из 1 мл воды и всех реактивов. Содержание гидроксиламина в микрограммах на 1 мл вычисляют по калибровочному графику. Калибровочный график. Перед определением 0,1%-ный раствор гидроксиламина разводят водой в 100 раз в мерной колбе, вместимостью 100 мл (10 мкг/мл). К 0,1 - 1,0 мл полученного (1 - 10 мкг гидроксиламина) раствора с интервалом 0,1 мл прибавляют воду до объема 1 мл, прибавляют реактивы и проводят анализ, как указано выше. Калибровочный график воспроизводят перед каждым определением.
|
