МУК 4.2.2314-08

│ │вылупл—е5ш Dq©_ҐђЌ›х10Фг,Lgr_>Lф_6Ќl±+І®­r

МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

 

1. Разработаны: Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского, ММА им. И.М. Сеченова (Н.А. Романенко, А.И. Чернышенко, Г.И. Новосильцев, Е.Н. Морозов, Н.А. Турбабина); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (А.И. Верещагин, И.В. Брагина, Т.Н. Цыбина, Т.Г. Сыскова, М.В. Зароченцев); кафедрой паразитологии, паразитарных и тропических болезней ММА им. И.М. Сеченова (В.П. Сергиев, Р.К. Мирзоева, М.В. Гузеева); ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве" (Н.И. Тимошенко); ГНЦ РФ Физико-энергетический институт (Б.И. Фурсов, Г.С. Жданов); ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г. Челябинске" (Б.Е. Рабинович); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Т.М. Гузеева, З.С. Середа); ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН (Ю.А. Рахманин, Р.И. Михайлова, А.Е. Недачин); ФГУП НИИ физических проблем им. Ф.В. Лукина (С.М. Кузьмин, Е.С. Кузьмин, С.М. Безручко); Тюменским НИИ КИП (Т.Ф. Степанова); ООО "СтайЛаб" (А.В. Галкин); РМАПО Минсоцразвития России (А.Е. Беляев); РАГС при Президенте РФ (В.В. Гутенев); Курским Госуниверситетом (Н.С. Малышева, С.С. Пехова, Н.А. Плехова, Е.Л. Дмитриева); ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Белгородской области" (В.В. Евдокимов, В.И. Евдокимов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 18 января 2008 г.

4. Введены взамен МУК 4.2.964-00 "Санитарно-паразитологическое исследование воды хозяйственного и питьевого использования".

 

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

 

1.1. Методические указания устанавливают методы лабораторного паразитологического контроля безопасности питьевой воды по нормируемым показателям СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества", СанПиН 2.1.4.1116-02 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества", СанПиН 2.1.2.1188-03 "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества".

1.2. Настоящие Методические указания являются обязательными для контроля питьевой воды по показателям паразитарной безопасности при проведении государственного санитарно-эпидемиологического надзора (контроля) в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке.

Допускается применение любого из указанных в настоящих МУК методов по выбору исполнителя.

Допускается использование аналогов оборудования, приборов, реагентов и материалов, указанных в настоящих МУК, разрешенных к применению в установленном порядке.

 

2. ОТБОР, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ ПРОБ

 

2.1. Общие требования к отбору проб питьевой воды

 

Отбор проб воды на объектах надзора проводится в соответствии с действующими нормативно-методическими документами (СанПиН, ГОСТ, МУК) и настоящими Методическими указаниями.

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения. Многоразовая посуда (емкости) должна быть изготовлена из материалов, выдерживающих обработку кипячением.

При исследовании воды из распределительной сети отбор проб производится из крана с предварительным спуском воды не менее 3 - 5 мин., с применением гибких шлангов, водораспределительных сеток, насадок. При отборе проб воды с концентрированием осадка на мембранных или порошковых фильтрах применяют насадки аппаратов напорного фильтрования, напор воды при этом регулируют с таким расчетом, чтобы он был достаточным для фильтрации через мембранные фильтры (МФАСП или АТМ).

При исследовании воды на объектах транспорта (водном, воздушном, железнодорожном) отбор проб воды производится на выходе из гидротехнических сооружений, осуществляющих водоснабжение данных транспортных средств.

Из открытых (поверхностных) водоемов, плавательных бассейнов пробы отбирают с поверхности, с различных глубин объемом 25 - 50 л, емкостями 1,5 - 2,0 л с интервалом 2 - 3 мин.

Забор проб воды с объекта (точки пробозабора) проводят несколькими способами:

1) отбор воды с каждой точки пробозабора обследуемого объекта по 25 - 50 л непосредственно в большие закрывающиеся емкости (фляги, бутыли, канистры и т.п.) и соответственно доставкой этих объемов воды для исследования в лабораторию;

2) отбор воды (по 25 - 50 л с каждой точки) с последующим концентрированием проб с применением химреактивов (коагулянтов) непосредственно на обследуемом объекте и доставкой на исследование в лабораторию уменьшенного в 10 и более раз объема (осадок с надосадочной жидкостью);

3) отбор проб воды с помощью фильтровальных приборов на объектах водозабора и доставкой на исследование в лабораторию концентрированного осадка на мембранных или порошковых фильтрах.

 

2.2. Хранение и транспортирование проб

 

В лабораторию доставляют маркированные емкости с пробами исследуемой воды или осадок с надосадочной жидкостью после применения коагулянтов, или концентрированный осадок на фильтрах (мембранных или порошковых).

Фильтры, через которые проводилось фильтрование исходной воды с помощью фильтровальных приборов непосредственно на объекте надзора, помещают в широкогорлый флакон или стеклянную банку, добавляют исходной (исследуемой) воды с таким расчетом, чтобы вода покрывала поверхность фильтра, закрывают флакон или банку завинчивающейся или притертой крышкой и доставляют в лабораторию. При использовании фильтровальных приборов с порошковым фильтром в лабораторию доставляют концентрат пробы в пластиковой емкости, входящей в состав прибора.

Емкости с пробами воды, мембранными фильтрами с концентрированным осадком или с порошковым концентратом маркируют с указанием даты и номера пробы, количества мембранных фильтров с одной точки пробоотбора. Маркированные пробы в лабораторию транспортируют для дальнейшего исследования с сопроводительным актом отбора проб воды, где указывается место отбора (населенный пункт, водный объект и т.п.), дата, время забора, количество точек пробоотбора, номера проб, количество воды или количество фильтров и другая информация.

Пробы воды должны быть доставлены в лабораторию в течение 24 ч после отбора. Пробы, не прошедшие предварительную обработку, хранят при комнатной температуре 15 - 20 °С не более двух суток. Концентрированные пробы можно хранить в холодильнике при температуре 2 - 4 °С в течение не более трех суток.

 

3. ОБОРУДОВАНИЕ, РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

 

3.1. Фильтровальное оборудование <*>

 

--------------------------------

<*> Допускается применение аналогичных приборов отечественных и зарубежных производителей, разрешенных к применению в установленном порядке.

 

Приборы мембранного фильтрования:

1) вакуумные фильтровальные установки типа ПВФ-142, ПВФ-35, ПВФ-47;

2) напорного фильтрования типа ПНФ, УППВ.

Приборы порошкового фильтрования:

1) напорного фильтрования - типа ПробоКонг и его модификации;

2) отборник флотанта фильтрующий типа "ОФФ-25".

 

3.2. Вспомогательное оборудование и расходные материалы

 

Лабораторная центрифуга типа ОПН-3, ОПН-8, ЦЛС-31М, ОС-6М со сменным ротором или другие марки с аналогичными параметрами, обеспечивающие 1500 - 3000 об./мин., позволяющие центрифугировать пробы воды в центрифужных пробирках объемом от 10 мл.

Низкотемпературный холодильный шкаф или холодильник бытовой, поддерживающий температуру 2 - 6 °С.

Термостат, поддерживающий рабочую температуру 37 °С и обеспечивающий градиент температуры в камере +/- 1 °С.

Весы лабораторные механические равноплечие (аптекарские) с наибольшим пределом взвешивания 1000 г, с допустимой погрешностью не более 0,1 г с разновесами или электронные с наибольшим пределом взвешивания 200 г, с допустимой погрешностью не более 0,01 г.

Ареометры с пределами измерения от 1,000 до 1,400 кг/куб. м.

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды не ниже ГОСТа 6709-72.

Шкаф сушильный, стерилизационный, обеспечивающий температуру до 180 °С.

Световые микроскопы отечественные типа МИКМЕД-2 (вариант 2) и других фирм, оснащенные окулярами с увеличением 10x (дополнительно могут быть 7x и 5x), объективами 10x, 40x, 100x. Окуляр-микрометр и объект-микрометр.

Мембранные фильтры для фильтрования воды на основе ацетатов целлюлозы типа МФАС-СПА с размерами пор от 1,5 до 3,0 мкм, МФАС-СПА-4 с размерами пор от 2,5 до 4,5 мкм или прозрачные аналитические трековые мембраны АТМ на основе полиэтилентерефталата с размерами пор от 1,0 до 5,0 и более мкм. Диаметр фильтровальных дисков 25, 35, 47, 70 и до 142 мкм, в зависимости от диаметра фритты фильтродержателя используемого фильтровального оборудования.

Предфильтры - капроновая сетка с ячейками 60 - 70 мкм.

Емкости для отбора проб воды из нейтрального материала, пригодные для обеззараживания (широкогорлые стеклянные или пластиковые флаконы емкостью 100 - 500 мл с притертым или завинчивающимися крышками, металлические или пластиковые канистры емкостью 10 - 25 л, стеклянные бутыли, фляги молочные металлические, эмалированные бидоны и др.).

Дозаторы пипеточные полуавтоматические с наконечниками.

Лабораторный вортекс, лабораторный ротатор.

Лабораторная посуда стеклянная одноразового или многоразового использования (химические стаканы, колбы, чашки Петри, цилиндры измерительные, пробирки центрифужные градуированные, микропробирки полипропиленовые, стеклянные палочки, стекла предметные, стекла покровные, пипетки стеклянные или разовые и т.п.).

Инструментарий металлический: пинцеты для работы с мембранными фильтрами, ножницы, иглы препаровальные, шпатели.

Лотки эмалированные, металлические, эмалированные кастрюли, ведра.

Горелки газовые или спиртовки.

Штативы лабораторные для пробирок и микропробирок.

Часы песочные на 3 - 5 мин., часы сигнальные или электронный таймер.

Кисти акварельные широкие (мягкие или полужесткие).

 

4. МЕТОДЫ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПРОБ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ

 

Концентрация больших объемов воды (50 л и более) на объектах позволяет пробу воды, предназначенную для доставки в лабораторию на исследование, уменьшить до 0,5 - 1,0 л.

Концентрирование больших объемов воды применимо также непосредственно в лабораториях, что позволяет не только уменьшить объемы исследуемых проб воды, но и хранить пробы перед исследованием в холодильнике до 3-х суток (п. 2.2).

Все пробы воды, которые сконцентрированы с применением химических реактивов (коагулянтов), исследуются после предварительной фильтрации через мембранные фильтры.

 

4.1. Концентрирование проб воды с применением

химических веществ

 

4.1.1. Концентрирование пробы воды

гидрокарбонатом кальция

 

К 10 л пробы добавить 100 мл 1 моль/л CaCl, затем 100 мл 1 моль/л

NaHCO. Встряхнуть емкость для перемешивания.

Добавить 100 мл 1 моль/л NaOH. Встряхнуть емкость для перемешивания.

Дать отстояться не менее 2 ч.

После осаждения хлопьев осторожно удалить из емкости надосадочную жидкость, оставив 4 - 5 см жидкости над осадком (даже если осадок невидим).

В осадок с надосадочной жидкостью добавить 100 - 200 мл 10%-й

сульфаминовой кислоты (NH SO H) для полного растворения хлопьев.

2 3

Хорошо перемешать содержимое емкости и перелить в центрифужные флаконы объемом 1000 мл или 500 мл, пронумерованные в соответствии с номером пробы.

Вода во флаконах должна иметь pH = 6 +/- 0,5, чтобы не было повторного образования хлопьев. При несоответствии pH осторожно отрегулировать раствором 1 моль/л NaOH.

Центрифугировать флаконы 10 мин. при 1500 - 2000 об./мин.

Сразу после центрифугирования осторожно удалить (слить) надосадочную жидкость или отсосать лабораторным вакуумным насосом с давлением не более 0,2 бар.

Энергично перемешать оставшуюся жидкость, ресуспендируя осадок, и перенести его в градуированную центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Довести объем в ней до 50 мл фильтрованной дистиллированной водой (сполоснуть центрифужный флакон дистиллированной водой и перенести в 50 мл центрифужную пробирку).

Центрифугировать пробирки 15 мин. при 2000 - 2500 об./мин.

Записать объем осадка сразу после центрифугирования.

Удалить надосадочную жидкость или отсосать пипетками, оставив 1 см над осадком.

Добавить дистиллированную воду в центрифужную пробирку, доведя объем до 5 мл.

Размешать осадок механическим встряхиванием в течение 10 - 15 с.

 

4.1.2. Концентрирование пробы воды

сульфатом железа (FeSO х 7H O)

4 2

 

На 10 л добавить 20 мл 1 моль/л раствор FeSO х 7H O, перемешать

4 2

механически в течение 5 мин. Довести значение pH до 9,0 +/- 0,2, добавив в

емкость 2 мл 1 моль/л раствора NaOH.

Оставить отстаиваться на ночь (12 - 18 ч) при комнатной температуре. Затем осторожно удалить надосадочную жидкость, оставив над осадком 4 - 5 см жидкости.

Перелить содержимое канистры в центрифужные флаконы объемом 1000 мл или 500 мл (сполоснуть канистру 10%-й щавелевой кислотой (100 - 150 мл) до полного растворения осадка сульфата железа и вылить раствор в центрифужный флакон).

Центрифугировать 10 мин. при 1500 - 2000 об./мин.

Осторожно удалить надосадочную жидкость или отсосать пипетками, оставив над осадком (даже если осадок невидим) 1 см жидкости.

Центрифугировать 10 мин. при 1500 - 2000 об./мин. Осторожно удалить надосадочную жидкость или отсосать пипетками, оставив 1 см над осадком.

Измерить лакмусовой бумагой pH концентрированного осадка и, если необходимо, отрегулировать до pH 7,2 - 7,4.

Перенести суспензию в градуированные центрифужные пробирки объемом 50 мл.

Довести объем в пробирках до 50 мл дистиллированной водой.

Центрифугировать 15 мин. при 1500 об./мин.

Записать объем осадка сразу после центрифугирования.

Осторожно удалить надосадочную жидкость или отсосать пипетками, оставив над осадком 1 см жидкости. Если нет видимого осадка, необходимо очень осторожно аспирировать надосадочную жидкость, не касаясь кончиком пипетки стенок и дна пробирки, чтобы избежать засасывания паразитарных объектов (цист и ооцист простейших).

Добавить в центрифужные пробирки дистиллированной воды, доведя объем до 10 мл.

Размешать осадок механическим встряхиванием в течение 10 - 15 с.

Недостаток метода:

1) на месте забора проб воды необходимо иметь дополнительное оборудование - центрифугу;

2) длительность отстаивания воды после добавления химических веществ (полдня и более), что не всегда возможно при ограниченности времени, отведенного на отбор проб.

 

4.2. Концентрирование осадка питьевой воды

на мембранных и порошковых фильтрах

 

Применяемые для фильтрования мембранные фильтры МФАС СПА или прозрачные АТМ укладывают на фильтродержатель (фритту) прибора вакуумного или напорного фильтрования и фильтруют через них исследуемую пробу воды в соответствии с инструкцией к прибору (п. 3.1).

По мере замедления процесса фильтрации из-за загрязнения фильтра его заменяют новым, использованный фильтр с осадком снимают пинцетом с фильтродержателя прибора и помещают в емкости для хранения и доставки в лабораторию в соответствии с п. 2.2. Использование в приборах предфильтров перед поступлением исследуемой воды на мембранный фильтр уменьшает вероятность их загрязнения крупными частицами.

В условиях лаборатории производится смыв осадка с мембранных фильтров в день отбора (фильтрования) и доставки проб. Исследование концентрированного смыва с мембранных фильтров проводится в лаборатории в соответствии с методиками в день доставки или не позднее 3-х суток с момента отбора проб, при условии хранения смыва в стеклянных емкостях в соответствии с п. 2.2.

Порошковая фильтрация осуществляется на приборах типа ПробоКонг и проводится в соответствии с инструкцией к прибору. Объем профильтрованной воды измеряют водосчетчиком, давление фильтрации - манометром. Фильтрование происходит через намывной порошковый фильтр гидробиологический (ПФГ), формируемый на опорной сетке потоком исследуемой воды. В качестве сменного корпуса фильтра применяют пластиковую бутылку, в которую после окончания фильтрации смывают слой порошкового фильтра с задержанными патогенами и транспортируют в лабораторию для дальнейшего исследования.

Метод обеспечивает возможность быстрого концентрирования больших (до 1000 л) объемов питьевой воды до 100 - 500 мл концентрата для дальнейшего исследования, простоту отделения паразитарных объектов от фильтрующего материала в процессе флотации, исключает необходимость отбора и транспортирования в лабораторию больших (>= 50 л) объемов питьевой воды.

 

5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОБ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ

 

Пробы воды после пробоподготовки (фильтрации) и получения концентрированных смывов осадка исследуются санитарно-паразитологическими, серологическими, молекулярно-биологическими методами для выявления возбудителей паразитарных болезней (яиц гельминтов и патогенных кишечных простейших).

Санитарно-паразитологические методы применяются при исследовании на яйца, личинки гельминтов и патогенных кишечных простейших (цист лямблий и ооцист криптоспоридий) (п. 5.1).

Серологические методы применяются для обнаружения антигена к специфическим антителам патогенных простейших (цисты лямблий и ооцисты криптоспоридий) в комплексе АГ + АТ (п. 5.2).

Молекулярно-биологическими методами (ПЦР) определяют специфические нуклеиновые кислоты ДНК или РНК паразитарного агента (цисты лямблий и ооцисты криптоспоридий) или его генетической мутации (п. 5.3).

Яйца и личинки гельминтов можно выявить только санитарно-паразитологическими методами.

Для выявления патогенных кишечных простейших (цист лямблий и ооцист криптоспоридий) можно применить любой из вышеперечисленных методов. Наиболее чувствительным является серологический метод иммуномагнитной сепарации с иммунофлуоресцентным мечением, который позволяет выявить цисты лямблий и ооцисты криптоспоридий даже при незначительной их концентрации в воде.

 

5.1. Методы санитарно-паразитологического исследования

проб питьевой воды и их концентратов

 

5.1.1. Метод порошковой фильтрации

 

Оборудование: отборник флотанта фильтрующий "ОФФ-25" в комплекте, центрифуга с качающимся ротором с прозрачными пластиковыми или стеклянными центрифужными стаканчиками объемом 100 - 150 мл.

Расходные материалы: аналитические трековые мембраны (АТМ) с диаметром диска 25 мм.

Реактивы и красители: раствор Люголя, красители или флуорохромы, флуоресцентно-меченые антитела, промывочные и фиксирующие растворы, флотирующая жидкость.

Порядок приготовления препарата для микроскопического исследования:

- взбалтывают смыв в бутылке и разливают по центрифужным стаканчикам, доливают дистиллированной воды до верха стаканчика;

- центрифугируют в качающемся роторе со скоростью 1000 - 1500 об./мин., 10 мин.;

- удаляют надосадочную жидкость.

Примечание 1.

Целесообразно провести предварительное отстаивание концентрата с целью уменьшения объема осадка. Для этого взбалтывают смыв ПробоКонга и дают ему отстояться 10 мин. для оседания крупной фракции. Надосадочную жидкость помещают в центрифужные пробирки. Полученный осадок также можно исследовать методом иммуномагнитной сепарации (п. 5.2) или ПЦР (п. 5.3);

 

- к осадку (примерно 20 мл без предварительного отстаивания) приливают флотирующую жидкость, объем которой должен в 5 раз превышать объем осадка (примерно 100 мл);

- осадок тщательно взбалтывают стеклянной палочкой и отмечают на стенке пробирки маркером уровень жидкости;

- наслаивают сверху 5 - 10 мм дистиллированной воды или применяемого физиологического раствора.

Примечание 2.

Наслоение воды или физраствора предотвращает прилипание зерен к стенкам пробирки и возможное последующее загрязнение ими препарата для микроскопирования, а также испарение воды из флотирующей жидкости с выпадением кристалликов соли на объектах, приводящим к их "потоплению".

Не рекомендуется наслаивать водопроводную воду, т.к. ионы кальция и магния, содержащиеся в ней, образуют нерастворимые сульфаты при контакте с флотирующей жидкостью на основе сульфата цинка, что приводит к помутнению флотанта и возможной забивке микропористой мембраны;

 

- центрифугируют со скоростью 1500 - 2000 об./мин. 10 мин., при этом паразитарные агенты всплывают, а частицы порошкового фильтра оседают.

Примечание 3.

Стаканчики в роторе должны быть установлены в предназначенные для них ячейки, недопустимо устанавливать их в ячейки или стаканчики большего диаметра так, чтобы они могли раскачиваться (совершать прецессию) во время центрифугирования, что приводит к перемешиванию границы слоев растворов.

Не рекомендуется останавливать центрифугу тормозом;

 

- с помощью отборника флотанта фильтрующего ОФФ-25 (по прилагаемой инструкции) отбирают флотант на прозрачную трековую мембрану, промывают ее дистиллированной водой от флотирующей жидкости, обрабатывают красителями или флуоресцирующими антителами.

Примечание 4.

При отсутствии ОФФ-25 флотант можно отсосать пипеткой и перенести в центрифужную пробирку, разбавить не менее чем в 5 раз дистиллированной водой, центрифугировать 5 мин. при 1500 об./мин., надосадочную жидкость удалить, из осадка готовить препараты для микроскопирования или исследовать его методом иммуномагнитной сепарации или ПЦР;

 

- на чистое предметное стекло наносят палочкой для иммерсионных жидкостей каплю глицерина и размазывают боковой поверхностью этой палочки на участке под фильтр;

- извлекают из ОФФ-25 мембрану пинцетом (согласно инструкции), касаются ее нижней стороной фильтровальной бумаги для удаления возможных капель воды и укладывают, постепенно опуская ее, начиная с края, на подготовленное предметное стекло, следя, чтобы не образовывались под мембраной пузыри; для лучшего пропитывания мембраны глицерином следует подождать несколько минут.

 

5.1.2. Флотационный метод исследования

 

Химреактивы

Один из флотационных растворов:

- 33%-й сульфат цинка семиводный ZnSO х 7H O хч, уд. плотностью

4 2

1,26 - 1,30;

- 30%-й водный раствор сахарозы уд. плотностью 1,26 - 1,30;

- раствор тиосульфата натрия (гипосульфита натрия) Na S O х 5H O хч,

2 2 3 2

уд. плотностью 1,3 - 1,4.

Вода дистиллированная; 40%-й раствор формалина; йод кристаллический хч, калий йодистый (KI) хч; метиленовый синий сухой хч; 1%-й раствор Люголя.

Приготовление флотационных растворов:

- 33%-й раствор сульфата цинка семиводный ZnSO х 7H O хч, уд.

4 2

плотностью 1,26 - 1,30: 331 г вещества растворить в 0,5 л горячей

дистиллированной воды, довести до 1 л и нагреть до кипения;

- 30%-й водный раствор сахарозы, уд. плотностью 1,26 - 1,30: 300 г сахарозы чда растворить в 0,5 л горячей дистиллированной воды, довести до 1 л и нагреть до кипения;

- раствор тиосульфата натрия (гипосульфита натрия) Na S O х 5H O хч,

2 2 3 2

уд. плотностью 1,3 - 1,4: 1300 г вещества на 1 л горячей дистиллированной

воды.

Любую из вышеперечисленных солей растворяют горячей водой в эмалированной посуде порциями при постоянном перемешивании до полного растворения, подогревая на медленном огне или электроплите. Контролируют удельную плотность флотационного раствора ареометром, когда температура раствора снизится до 18 - 20 °С.

Приготовление рабочих растворов химреактивов:

- 1%-й раствор Люголя: 5 мл 5%-ого маточного раствора Люголя + 20 мл физиологического раствора (срок хранения в темном стекле 14 дней);

- 5%-й маточный раствор Люголя: 10 г йодида калия растворить в 30 мл дистиллированной воды + 5 г кристаллического йода, размешать до полного растворения и долить до 100 мл дистиллированной водой (хранить в темном стекле);

- 2%-й водный раствор формалина: 1 часть 40%-го формальдегида растворяют в 20 частях дистиллированной воды.

Ход исследования:

1. Пробу воды фильтруют на одном из фильтровальных приборов (в соответствии с паспортом и инструкцией) через мембранные фильтры типа МФАС-СПА или прозрачные аналитические трековые мембраны (АТМ <*>), или порошковый фильтр гидробиологический (ПГФ).

--------------------------------

<*> Концентрированный осадок, полученный на прозрачных аналитических трековых мембранах (АТМ) после фильтрации воды, можно исследовать под микроскопом непосредственно без предварительного смыва (п. 5.2).

 

2. Осадок с мембранных фильтров смывают кисточкой в 10 мл дистиллированной воды (на один фильтр) в химический стакан, чашку Петри или лоток. При использовании порошкового фильтра гидробиологического его необходимо отстаивать в течение 10 мин. и исследовать надосадочную жидкость.

3. Весь полученный смыв с мембранных фильтров или после концентрации химреактивами, или надосадочную жидкость порошкового фильтра центрифугируют в пробирках емкостью 10 мл и более в течение 5 мин. при 1500 об./мин.

4. Надосадочную жидкость осторожно удаляют.

5. В пробирку с осадком добавляют 6 - 8 мл дистиллированной воды или 2%-го водного раствора формалина (если не проводится исследование на жизнеспособность) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

6. Суспензию вновь центрифугируют в течение 5 мин. при 1500 об./мин.

7. Надосадочную жидкость осторожно удаляют или отсасывают пипеткой.

8. К осадку добавляют 3 мл одного из флотационных растворов с удельным весом 1,3 - 1,4, но не менее 1,26 и тщательно перемешивают стеклянной палочкой.

9. Центрифугируют в течение 5 мин. при 2000 об./мин. или 10 мин. при 1500 об./мин.

10. Далее исследуют надосадочную жидкость, которую осторожно отсасывают пипеткой и переносят в центрифужную пробирку, разбавляя в 4 раза дистиллированной водой, и центрифугируют в течение 5 мин. при 1500 об./мин.

11. Надосадочную жидкость осторожно удаляют или отсасывают пипеткой.

12. Из осадка готовят препараты в виде мазка или капли (в зависимости от прозрачности осадка) на предметных стеклах, покрывают покровным стеклом и микроскопируют при увеличении микроскопа: объектив 10x - 40x, окуляр 10x. Для исследования на цисты лямблий микропрепараты до нанесения покровного стекла окрашивают 1%-м раствором Люголя.

Применение метода:

1) для исследования концентрированного осадка (смыва) воды после фильтрации через мембранные или порошковые фильтры;

2) для выявления в воде яиц гельминтов и цист лямблий.

 

5.1.3. Метод последовательной фильтрации через систему

прозрачных аналитических трековых мембран (АТМ)

 

5.1.3.1. Исследование на яйца, личинки

гельминтов и цисты лямблий

 

Химреактивы: дистиллированная вода, 50%-й раствор глицерина, 1%-й раствор Люголя.

Ход исследования

1. Предварительно на заборное устройство прибора для фильтрования ПВФ-142 крепят предфильтр в виде капроновой сетки с размерами ячейки 67 - 70 мкм (поставляется в комплекте с АТМ).

2. Аналитическую трековую мембрану (АТМ) с диаметром пор 5,0 мкм помещают на фритту фильтродержателя прибора для фильтрования и сверху укладывают фильтр с размером пор 25,0 мкм, уплотняют кольцом из эластичной резины. Для плотного (без складок) прилегания АТМ к фритте рекомендуется смочить мембрану дистиллированной водой и плотно уложить на фритту фильтродержателя.

3. После фильтрации обе мембраны последовательно по одной осторожно снимают пинцетом с фритты фильтродержателя на заранее подготовленные тонкие пластмассовые квадратные пластинки размером 150 х 150 мм (поставляются в комплекте с АТМ) и переносят в лоток.

4. Профильтрованную в отдельную емкость пробу воды повторно фильтруют с использованием АТМ с диаметром пор 2,5 мкм, которую укладывают на фритту фильтродержателя между двумя уплотнительными кольцами из полиэтилена или обрезиненного лавсана (поставляются в комплекте с АТМ).

5. После фильтрации АТМ осторожно снимают пинцетом с фритты на пластиковый диск, который должен быть помещен в лоток. Со всех трех фильтров аккуратно и тщательно, придерживая диск с мембраной пинцетом за край, производят смыв осадка с обеих поверхностей мембран и с пластиковых дисков, на которых эти фильтры лежали. Смыв проводят плоской, средней жесткости кисточкой в лоток с дистиллированной водой. При этом периодически споласкивают мембраны и диски дистиллированной водой из химического стакана. Общий объем дистиллированной воды при смыве осадка со всех 3-х фильтров не должен превышать 300 - 500 мл.

6. Полученный концентрированный смыв сливают из лотка в воронки прибора для фильтрации типа ПВФ-35 или ПВФ-47 и фильтруют через аналитические мембраны АТМ с диаметром пор 3,0 - 2,5 мкм. В зависимости от первоначальной загрязненности воды фильтруют последовательно, меняя мембраны.

7. После фильтрации мембраны АТМ осторожно снимают пинцетом с фильтродержателя (фритты) фильтровального прибора и переносят на предметное стекло, предварительно обработав его 50%-м раствором глицерина (для этого на поверхность предметного стекла наносят 1 - 2 капли 50%-го раствора глицерина и стеклянной палочкой распределяют по всей поверхности тонким слоем), затем сверху мембраны наносят каплю 1%-го раствора Люголя и накрывают покровными стеклами (24 х 24 мм) всю поверхность мембраны.

8. Микроскопируют препарат при увеличениях: окуляр 7x или 10x; объектив 10x; для идентификации яиц гельминтов и исследования на цисты лямблий - объектив 40x.

 

5.1.3.2. Исследование на ооцисты криптоспоридий

 

Химреактивы: спирт 96%-й, дистиллированная вода, смесь Никифорова (равные пропорции этилового эфира и спирта 96%-го); краска по Циль-Нильсену промышленного изготовления или реактивы для ее приготовления (фенол кристаллический, фуксин основной, 5%-й раствор серной кислоты; 0,2%-й водный раствор метиленового синего или 5%-й раствор малахитовой зелени на 10%-м этиловом спирте); иммерсионное масло.

Приготовление раствора краски по Циль-Нильсену: фуксин основной 2 г растворить в 12 мл спирта 96%-го; фенола 5 г растворить в 50 мл дистиллированной воды; слить вместе растворы фуксина и фенола, долить дистиллированной воды до 100 мл и тщательно перемешать.

Ход исследования

1. После фильтрации пробы воды через прозрачную аналитическую трековую мембрану АТМ диаметром пор 2,5 - 3,0 мкм на фильтровальном приборе или получения концентрированного смыва (п. 5.3.1) мембрану тщательно высушивают в лотке на воздухе.

2. Фиксируют в смеси Никифорова 5 мин.

3. После фиксации мембрану вновь тщательно высушивают в лотке на воздухе.

4. Затем окрашивают фильтр АТМ в кювете (лотке, чашке Петри) карболовым фуксином (краска по Циль-Нильсену) в течение 20 мин.

5. После окраски фильтры промывают под проточной водой, предварительно закрепив АТМ за край химического стакана, с таким расчетом, чтобы струя воды не попадала на поверхность мембраны, а закрепленный фильтр свободно плавал в воде. Фильтр считается промытым, когда из стакана польется прозрачная вода.

6. Обесцвечивают (дифференцируют) 5%-м раствором серной кислоты в течение 10 с и снова промывают (согласно п. 5).

7. Дополнительно окрашивают 0,2%-м водным раствором метиленового синего (входит в состав краски по Циль-Нильсену, промышленного приготовления) или 5%-м раствором малахитовой зелени (приготовленном на 10%-м этиловом спирте) в течение 3 - 5 мин. Промывают под струей проточной воды (согласно п. 5).

8. Пинцетом фильтр из воды переносят в кювету (лоток, чашку Петри) и тщательно высушивают на воздухе.

9. Сухой окрашенный фильтр (АТМ) помещают на предметное стекло, предварительно смазанное тонким слоем иммерсионного масла (для лучшей адгезии), накрывают покровным стеклом и микроскопируют под иммерсией при увеличении микроскопа: окуляр 10x, объектив 90x или 100x.

Результат окрашивания: ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки ярко-красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований диаметром 5 - 6 мкм с отчетливо видимой оболочкой и структурированным содержанием (можно наблюдать наличие 4 веретенообразных темноокрашенных спорозоитов) на синем (сиреневом) или зеленом основном фоне.

 

5.2. Исследование воды на цисты лямблий и ооцисты

криптоспоридий методом иммуномагнитного разделения

и мечения флуоресцирующими антителами (IMS)

 

Метод представлен двухэтапной реакцией, при которой обнаружение искомого антигена в комплексе антиген - антитело (АГ - АТ) происходит с помощью иммуномагнитной суспензии (для выделения: ооцист криптоспоридий - Cryptosporidium Beads, цист лямблий - Giardia Beads.

Реагенты и химреактивы диагностического набора AquaGlo G/C:

иммунореагент (импортного производства) AquaGlo G/C концентрированный или в рабочем разведении);

фосфатный буфер в таблетках (PBS) или концентрированный солевой моющий буфер 20XWash Buffer;

ТМ ТМ

защитная среда No-Fade, M101 или Elvanol No-Fade, M102;

контрастирующий реагент, C101 (Contersain);

контроль положительный (взвесь с цистами лямблий и ооцистами криптоспоридий) Positiv Control: G. lamblia, C. parvum.

Реагенты и химреактивы диагностического набора Aureon CG Kit:

иммуномагнитная суспензия Cryptosporidium Beads, специфичная к ооцистам криптоспоридий;

иммуномагнитная суспензия Giardia Beads, специфичная к цистам лямблий;

ТМ

буфер для иммуномагнитной сепарации IMS Buffer;

ТМ

моющий буфер IT-Wash Buffer;

концентрированный раствор 2-меркаптоэтанола 14,3 М (2-меркаптоэтанола, готовый раствор 20 мМ готовить свежим непосредственно перед проведением анализа, разбавляя концентрированный 14,3 М раствор в отношении 1:700).

Примечание: возможно применение диагностических наборов, в состав которых могут входить, например, другие контрастирующие вещества - метящий раствор 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). Все изменения в проведении реакции регулируются инструкцией к применению диагностического теста.

 

Материалы и оборудование:

слайды SuperStick: S100-1 (одно окно), S100-2 (два окна), S100-3 (три окна);

покровные стекла;

бумажные салфетки;

стеклянные палочки;

ячейка влажности;

пастеровские пипетки стеклянные или разовые полистироловые;

инкубатор или водяная баня (37 и 50 °С);

наклонный штатив для слайдов;

фен или специальное устройство для подсушки слайдов;

ТМ

магнитный штатив MagnetOn 4T;

магнитная ручка SepPen;

наконечники для магнитной ручки;

автоматические пипетки на 100 - 1000 мкл;

наконечники для автоматических пипеток;

градуированная пипетка на 5 мл;

лабораторный вортекс;

лабораторный ротатор;

лабораторный таймер;

пробирки для иммуномагнитной сепарации (ИМС-пробирки с одной плоской стороной);

микроцентрифужные пробирки на 1,5 - 2,0 мл типа "Epindorf";

штатив для ИМС-пробирок;

штатив для микроцентрифужных пробирок;

люминесцентный микроскоп с набором необходимых фильтров и принадлежностей в рекомендованной комплектации;

канадский бальзам или бесцветный маникюрный лак.

Ход исследования

Этап I. Выделение ооцист криптоспоридий и цист лямблий из воды с помощью метода иммуномагнитной сепарации (IMS).

1) Подготовка проб к исследованию

После фильтрации воды осадок с фильтров смывают в 10 мл дистиллированной воды, переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин. при 1500 об./мин. Удаляют надосадочную жидкость и осадок исследуют. При этом осадок должен быть не более 1 мл. Если получился больший объем осадка, его необходимо ресуспендировать дистилл