Преподаватель Васильева С.В.
1. Подготовлены: ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского ММА им. И.М. Сеченова; кафедра паразитологии, паразитарных и тропических болезней МПФ ППО ММА им. И.М. Сеченова; Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора; Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН; Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора; ФГУЗ ЦГиЭ в г. Москве; ВИГИС; Курский государственный университет; ФГУЗ ЦГиЭ в Ханты-Мансийском автономном округе; ФГУЗ ЦГиЭ в Тульской области. 2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23 июля 2010 г. 3. Введены взамен методических указаний "Методы санитарно-паразитологических исследований" МУК 4.2.796-99.
1. Назначение и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы лабораторного контроля за объектами окружающей среды (почва, вода, бытовые и ливневые стоки, их осадки, навоз и навозные стоки, предметы обихода и другие), а также для проведения сертификационных испытаний приборов, установок отечественного и импортного производства (например, биотуалеты, водоочистные устройства индивидуального и коллективного пользования и другие) по паразитологическим показателям и определения эффективности средств и методов дезинвазии. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих санитарно-паразитологический контроль факторов внешней среды, а также могут быть использованы лабораториями организаций, осуществляющих производственный контроль, и научных учреждений, занимающихся изучением особенностей эпидемиологии паразитарных болезней и научно обосновывающих мероприятия по охране окружающей среды от загрязнения и защите здоровья населения.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения". 2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554 "Об утверждении Положения о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации и Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании". 2.3. Постановление Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека". 2.4. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней" и дополнение СП 1.3.2518-09. 2.5. СанПиН 3.2.1333-03 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации". 2.6. СанПиН 2.1.7.573-96 "Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения". 2.7. СанПиН 2.1.7.1287-03 "Санитарно-эпидемиологические требования к качеству почвы". 2.8. МУ 3.2.1756-03 "Эпидемиологический надзор за паразитарными болезнями". 2.9. МУ 2.1.7.730-99 "Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест". 2.10. ГОСТ Р 17.4.3-01.83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб". 2.11. ГОСТ Р 17.4.4.02-84 "Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического анализов". 2.12. ГОСТ Р 17.4.3.07-2001 "Охрана природы. Почвы. Требования к свойствам осадков сточных вод при использовании их в качестве удобрений".
3. Оборудование, расходные материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Оборудование
Шкаф вытяжной универсальный, обеспечивающий биологическую и химическую защиту Холодильник электрический бытовой Термостат электрический (ТС-80 или аналогичный) Центрифуги для исследования почвы, иловых осадков, сточных вод, смывов напольные и (или) настольные Световые микроскопы современного поколения со сменными объективами (в том числе для иммерсионного микроскопирования - x90, x100) и окулярами Стереоскопический микроскоп (типа МБС) Люминесцентный микроскоп "ЛЮМАМ" или его аналог Осветитель к микроскопу ОИ-19 или другой аналогичный Столик нагревательный к микроскопу Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности, максимальный предел взвешивания 200 г Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности, максимальный предел взвешивания 1 кг Аппарат для встряхивания Денсиметры (ареометры типа I (A1) с пределами измерения от 1,000 до 1,600 кг/куб. м ГОСТ 1300-74 Приборы вакуумного фильтрования ПВФ-142/Э или ПВФ-142/ЭМ, отборник флотанта фильтрующий "ОФФ-25" или эквиваленты Пробоотборник-концентратор "ПробоКонГ-СЭС" или эквивалент Пылесос, электрощетка Моющий пылесос Аппарат Бермана Термовлагобарометр БМ-2 Часы песочные на 3 и 5 мин. или часы сигнальные Дозаторы пипеточные П 1-0,1; П 1-0,5; П-1,0 мл или аналогичные со сменными наконечниками ТУ 64-339-81
3.2. Расходные материалы
Пинцеты анатомические Кисти жесткие (из щетины) и мягкие (из волоса белки, колонка или соболя) для живописи N 12 - 18 Штативы лабораторные для пробирок ТУ 61-1-707-80 Иглы препаровальные Совки, шпатели, ложки, лопаты, бур Некрасова Пластиковые мешки и пакеты Мембранные фильтры с размером пор 1 - 4 мкм и диаметром мембранного диска, соответствующим размерам фильтродержателя фильтровального устройства Трековые мембраны с размером пор от 0,5 до 5 мкм Ситечки с металлической или капроновой сеткой (размер ячеек 0,25 - 0,3 мм) Резиновые груши разных размеров Скальпели анатомические Ножницы анатомические разных размеров Счетная камера (для количественного учета яиц гельминтов) Маркер (карандаш) по стеклу Лейкопластырь Скотч Клеенка и фартук клеенчатый Перчатки резиновые Весы для уравновешивания центрифужных пробирок Кюветы эмалированные разных размеров и почкообразные Корнцанги Пинцеты глазные Штатив Бунзена Треножник Горелки газовые Трубки резиновые Сложная петля Поплин, перкаль, сатин Ножи почвенные Сита почвенные с сеткой 0,25; 0,5; 1; 3 мм Шпатели металлические Шпатели пластмассовые Калька и пергамент Коробки картонные Другие расходные материалы, в том числе перевязочные (вата, марля, разовые полотенца, салфетки и пр.)
3.3. Лабораторная посуда
3.3.1. Стаканы стеклянные высокие с носиком (ВН) номинальной вместимостью 50 - 100 мл ГОСТ 10394-63 Пробирки центрифужные градуированные (ПЦГ) емкостью 10, 50, 100 и 250 мл ГОСТ 1770-64 Стекла предметные размером 25 x 75 мм; 60 x 120 мм Стекла покровные размером 18 x 18; 24 x 24 мм ГОСТ 6672-99 Чашки биологические (Петри) ГОСТ 25336-82 Емкости для отбора проб воды, осадков, навоза и навозных стоков из нейтрального материала, пригодные для обеззараживания принятыми методами: канистры пластмассовые емкостью 1; 2; 5; 20 и 25 л; стеклянные бутылки; фляги металлические емкостью 30 - 35 л; эмалированные бидоны; ведра 8 - 10 л; тазы, пластмассовые фляги емкостью 20 - 40 л или пластмассовые баки емкостью 50 л с диаметром более 40 см Цилиндры измерительные с носиком 1-00, 1-25, 1-500 ГОСТ 1770-74 Колбы 2-50-2, 2-100-2, 1-1000 ГОСТ 1770-74 Капельница для многократной дозировки по Манну ГОСТ 9876-61 Широкогорлые стеклянные или пластиковые флаконы емкостью 100; 500; 1000; 2000 мл с притертыми или завинчивающимися крышками Спиртовки лабораторные стеклянные Цилиндры градуированные с носиком на 1,5 - 2,0 л Стеклянные воронки разных размеров Часовые стекла разных размеров Стеклянные палочки Пипетки градуированные от 1 до 10 мл Банки стеклянные с притертыми или резиновыми пробками разных размеров до 500 мл Банки стеклянные широкогорлые до 2 л Банки фарфоровые без крышек 500 мл Бутыли (1 - 5 л) с тубусом для дезинфицирующих растворов Пробирки химические Кружки фарфоровые с ручками разных размеров Ступки и пестики фарфоровые разных размеров Мензурки на 100; 250; 500; 1000 мл Кристаллизаторы стеклянные
3.4. Химические реактивы
Натрий едкий Нитрат натрия, ч.д.а. Нитрат калия (калиевая селитра) Нитрат аммония или гранулированная селитра (аммиачная) Хлорид цинка Нитрат свинца Формальдегид 40%-ный Кислота соляная с массовой долей 3% Масло касторовое Сульфат железа Сульфат меди Спирт этиловый ректифицированный технический Сульфат цинка семиводный, х.ч. Сахароза, ч.д.а. Сульфат магния, ч.д.а. Тиосульфат натрия Вода дистиллированная Натрий хлористый, х.ч. Изотонический раствор натрия хлористого с массовой долей 0,85% (физиологический раствор, жидкость Барбагалло) Йод кристаллический, х.ч. Калий йодистый, х.ч. Эозин сухой, х.ч. Метиленовый синий сухой, х.ч. Кислота молочная, х.ч. Панкреатин Пепсин (возможен искусственный) Трипсин Натрий двууглекислый, ч.д.а. Сульфат алюминия Хлорное железо Хлористоводородная кислота Глицерин Раствор Люголя Ацетон Бензол Ксилол Бриллианткрезилблау синий (1:10000) Известь хлорная Серная кислота Калий двуххромовокислый Иммерсионное масло Хромпик Метиленовый синий Молочная кислота Раствор йода спиртовой 5%-ный Толуидиновый синий (1:1000) Сафранин (1:10000 спирта 10 °C) Индигокармин Раствор пирогалловой кислоты 50%-ный Нейтральрот (1:1000) Акридиновый оранжевый Корифосфин Примулин Аурамин Сульфат берлерина Трипафлавин Риванол Акрихин Мертиолят
3.5. Насыщенные растворы
3.5.1. Для методов флотации используют насыщенные растворы с заданной плотностью, которые следует готовить непосредственно перед применением (табл. 1). Количество солей на 1 л воды для различных насыщенных растворов приводится в табл. 3. В случае хранения готовых насыщенных растворов перед проведением исследований необходимо проверять их плотность ареометром (денсиметром). Насыщенные растворы с плотностью ниже требуемой не использовать.
Таблица 1
НАСЫЩЕННЫЕ РАСТВОРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ МЕТОДОВ ФЛОТАЦИИ
┌─────────────────────────┬───────────────────┬───────────────────────────┐ │ Насыщенный раствор │ Плотность │ Состав раствора │ │ │ ├────────────────┬──────────┤ │ │ │количество солей│количество│ │ │ │ │ воды │ ├─────────────────────────┼───────────────────┼────────────────┼──────────┤ │Раствор нитрата натрия │1,38 - 1,40 │нитрат натрия │1 л │ │ │ │1000 г │ │ ├─────────────────────────┼───────────────────┼────────────────┼──────────┤ │Раствор нитрата аммония │1,3 │нитрат аммония │1 л │ │или гранулированной │ │1500 г │ │ │аммиачной селитры │ │ │ │ ├─────────────────────────┼───────────────────┼────────────────┼──────────┤ │Раствор Брудастова │в свежем растворе: │натриевая │1 л │ │ │1,47 - 1,48; │селитра - 900 г,│ │ │ │через 24 часа │калиевая │ │ │ │снижается до 1,40 │селитра - 400 г │ │ ├─────────────────────────┼───────────────────┼────────────────┼──────────┤ │Раствор тиосульфата │1,4 │1750 г │1 л │ │натрия (гипосульфита │ │Na S O x 5H O │ │ │натрия) │ │ 2 2 3 2 │ │ └─────────────────────────┴───────────────────┴────────────────┴──────────┘
3.5.2. Для приготовления насыщенных растворов насыпают соль в эмалированное ведро с горячей водой порциями при постоянном помешивании до полного растворения. Раствор доводят до кипения, пока не появится на его поверхности кристаллическая пленка. Приготовленный раствор после остывания переливают в другие крупные емкости (бутыли). О насыщенности раствора судят по наличию на дне сосудов кристаллов соли и (или) измеряют ареометром его плотность. Образующийся на дне сосуда осадок используют при следующем приготовлении насыщенного раствора.
4. Методы исследования почвы
4.1. Отбор проб, транспортировка, хранение и подготовка к исследованию
Периодичность (частота) санитарно-паразитологического исследования почвы зависит от цели лабораторного контроля. Количество и размер пробных площадок на обследуемой территории закладывается с учетом эпидемиологической значимости объекта и его общей площади. Отбор проб почвы для паразитологических анализов с целью оценки качественного состояния почв естественного и нарушенного сложения проводят не менее 1 раза в год. Отбор проб почвы на территории детских, лечебно-профилактических учреждений и зон отдыха проводят не менее 2 раз в год - весной и осенью. При изучении динамики самоочищения почвы от яиц гельминтов, цист кишечных простейших отбор проб проводят в течение первого месяца наблюдений еженедельно, а затем ежемесячно в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения. Так, на территории расположения детских и лечебно-профилактических учреждений, игровых площадок, выгребов, мусорных ящиков и других объектов, занимающих небольшие площади, размер пробной площадки должен быть не более 5 x 5 м. При оценке качества почв сельскохозяйственных угодий учитываются характер источника загрязнения, возделываемой культуры и рельефа местности: на каждые 0,5 - 20,0 га территории закладывают не менее 1 пробной площадки размером 10 x 10 м. С каждой пробной площадки отбирается 1 объединенная проба весом 200 г, состоящая из 10 точечных проб массой 20 г каждая. Точечные пробы отбирают на пробной площадке методом конверта, по диагонали или любым другим способом с таким расчетом, чтобы каждая проба представляла собой часть почвы, типичной для генетических горизонтов или слоев данного типа. Точечные пробы отбирают ножом, совком или шпателем из прикопок или почвенным буром Некрасова послойно с поверхности и глубины 10 - 20 см. При необходимости отбор проб проводят из более глубоких (40 - 60 см) слоев почвы послойно. Объединенную пробу составляют путем смешивания 10 точечных проб, отобранных на одной пробной площадке. Пробы помещают в банки с крышками или пакеты из клеенки, пластика, этикетируют с указанием места отбора, даты, глубины, характера исследуемого участка (в тени или на солнце, состав почвы, наличие растительности и т.д.). В этикетке обязательно разборчиво указывается фамилия и должность отборщика пробы и представителя учреждения, на территории которого отбирались пробы. Все объединенные пробы должны быть зарегистрированы в журнале, пронумерованы. В процессе транспортирования и хранения почвенных проб должны быть приняты меры по исключению возможности их загрязнения. Паразитологический анализ проб почвы проводят в день доставки их в лабораторию. При невозможности немедленного проведения исследований пробы почвы хранят в холодильнике при температуре около 5 °C. Для исследования на цисты кишечных патогенных простейших почву без обработки хранят не более 2 суток; на яйца биогельминтов - до 7 суток, а на яйца геогельминтов - не более 1 месяца. Для предотвращения высыхания и развития личинок в яйцах геогельминтов почву увлажняют и аэрируют один раз в неделю, для чего пробы вынимают из холодильника и оставляют на 3 ч при комнатной температуре, увлажняют водой по мере потери влаги и снова помещают для хранения в холодильник. При необходимости хранения проб почвы более месяца применяют консервирующие средства: почву пересыпают в кристаллизатор, заливают жидкостью Барбагалло или 3%-ным раствором соляной кислоты, а затем ставят в холодильник. Перед исследованием объединенную пробу почвы рассыпают на бумаге или кальке, разминают пестиком крупные комки, выбирают из нее корни растений, камни, насекомых, стекло, уголь, кости животных и др. Затем почву переносят в ступку, растирают пестиком и просеивают через сито с ячейками диаметром 1 мм. Этот материал исследуют на яйца гельминтов и на цисты простейших. 4.1.1. При обнаружении возбудителей гельминтозов определяют: - вид возбудителя; - жизнеспособность; - экстенсивный показатель загрязнения (отношение числа положительных проб к числу исследованных проб); - интенсивный показатель загрязнения (общее количество возбудителей в 1 кг или 100 г почвы); - категория загрязнения почв (чистая, умеренно опасная, опасная, чрезвычайно опасная) в соответствии с СанПиН 2.1.7.1287-03.
4.2. Исследование почвы на яйца гельминтов. Метод Романенко (1996)
Ход исследования. Из объединенной пробы берут на исследование 4 порции по 25 г почвы, помещают их в центрифужные пробирки объемом 250 мл (в случае отсутствия таковых можно пользоваться пробирками объемом 80 - 100 мл, но помещать в них следует не более 15 г почвы) и заливают 3%-ным раствором натриевой или калиевой щелочи (в соотношении 1:1). После этого содержимое пробирок тщательно размешивают, отстаивают в течение 20 - 30 мин. и центрифугируют 5 мин. при 800 об./мин. Надосадочную жидкость сливают, а почву промывают водой (1 - 5 раз, в зависимости от типа почвы: для песчаных и супесчаных - достаточно одной промывки, для глинистых, суглинистых, черноземных - от 2 до 5) до получения прозрачной надосадочной жидкости. После добавления очередной порции промывочной воды осадок на дне центирифужной пробирки тщательно перемешивают при каждом промывании. После промывки к почве добавляют насыщенный (плотность 1,38 - 1,40) раствор нитрата натрия. Объем насыщенного раствора зависит от величины стакана (пробирки): в 250 мл стаканы добавляют по 150 мл насыщенного раствора, в более мелкие пробирки, например объемом 80 - 100 мл соответственно 45 - 50 мл насыщенного раствора. Почву тщательно размешивают, полученную смесь центрифугируют. Пробирки устанавливают в штатив, доливают тем же насыщенным раствором соли до уровня на 2 - 3 мм ниже краев пробирок и накрывают предметными стеклами. Яйца гельминтов всплывают и концентрируются в поверхностной пленке насыщенного раствора. Очень важно исключить какую-либо потерю поверхностной пленки. Для этого между краем пробирки и предметным стеклом оставляют пространство шириной не более 10 мм, куда с помощью пипетки вносят насыщенный раствор соли до его соприкосновения с нижней стороной стекла, которое осторожно передвигают до полного покрытия центрифужной пробирки. Через 20 - 25 мин. отстаивания стекла снимают, переворачивая нижней поверхностью вверх, а на их место ставят другие (при необходимости и третьи). На предметные стекла с поверхностной пленкой наносят 1 - 2 капли 30%-ного раствора глицерина, накрывают их покровными стеклами, а затем микроскопируют. Для обнаружения яиц гельминтов препарат просматривают при увеличении в 80, а для определения степени их развития или деформации - в 400 раз. При необходимости приготовленные препараты можно хранить в холодильнике до 5 - 7 суток, не допуская подсыхания. При подсыхании препаратов по краям покровных стекол добавляют несколько капель 30%-ного раствора глицерина. Для оценки результатов число яиц, обнаруженных в 4-х порциях пробы, умножают на 10, получая показатель содержания яиц в 1 кг исследуемой почвы. Эффективность метода колеблется от 59,6 - 83,1%, в среднем - 73,0%. Для определения истинной обсемененности почвы яйцами аскарид и власоглава необходимо использовать поправочные коэффициенты для различных типов почв (табл. 2), для чего необходимо определить тип почвы, а затем умножить число обнаруженных яиц гельминтов одного вида на коэффициент для этого типа почвы и для данного вида гельминта. Тип почвы должен быть определен при отборе проб и указан в сопроводительных документах.
Таблица 2
ПОПРАВОЧНЫЕ КОЭФФИЦИЕНТЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИСТИННОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ПОЧВ ЯЙЦАМИ АСКАРИД И ВЛАСОГЛАВОВ
Для обнаружения в почве яиц гельминтов, имеющих более высокую плотность (яйца описторхов, клонорхов), чем яйца аскарид и власоглавов, следует использовать насыщенный раствор хлорида цинка (плотность 1,78); яйца токсокар лучше выявляются при обработке почвы насыщенным раствором сульфата цинка или сульфата магния в смеси с 5%-ным раствором йодата калия. Примечание. При работе по данной методике необходимо строго соблюдать следующие требования: 1. Обязательность применения обезжиренных предметных стекол. 2. Обязательность контроля плотности насыщенного раствора с помощью ареометра (плотность должна быть не ниже 1,38 - 1,40). В случае нарушения указанных требований, поверхностная пленка с яйцами гельминтов не прилипнет к стеклу, а скорость всплывания яиц гельминтов замедлится, и в указанные сроки они не достигнут поверхностной пленки.
Для эффективного использования рабочего времени исследователя рекомендуется: во время первого отстаивания смеси "почва с щелочью" проводить подготовку предметных и покровных стекол, запись в журнале; во время второго - "почвы с насыщенным раствором соли" - подготовку рабочего места для микроскопирования, уборку центрифуги и другого лабораторного оборудования. После окончания проведения анализов использованную посуду (центрифужные пробирки, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки) замачивают в стиральном порошке и кипятят 15 - 20 мин., затем моют в чистой воде. Стекла протирают хлопчатобумажной тканью и помещают для обеззараживания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло), где они могут храниться длительное время. Извлеченные из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной тканью, заворачивают в бумагу небольшими партиями и стерилизуют.
4.3. Исследование почвы на яйца гельминтов. Метод Васильковой и Гефтер (1955)
Ход исследования. Из объединенной пробы берут навеску 50 г почвы, помещают в центрифужную пробирку емкостью 250 мл. Одновременно ведется обработка почвы из 4-х проб. Отобранные навески заливают 3%-ным раствором щелочи (NaOH, KOH) или 1%-ным раствором стирального порошка "Лотос" (или другим СМС) в соотношении 1:2 на 60 мин. для размягчения почвы. Содержимое пробирок тщательно перемешивают стеклянными палочками или электромешалкой в течение 5 мин., а затем центрифугируют 5 мин. при 800 - 1000 об./мин., надосадочную жидкость сливают (при обработке черноземной, торфяной почвы или илового осадка обработку щелочью повторяют и промывают от 1 до 5 раз в зависимости от типа почвы до получения прозрачной надосадочной жидкости). К осадку добавляют насыщенный раствор азотнокислого натрия (удельный вес 1,38 - 1,40) в соотношении 1:2, тщательно перемешивают стеклянной палочкой 5 мин., уравновешивают и центрифугируют 5 мин. при 800 - 1000 об./мин. Эта процедура повторяется 3 раза. После каждого центрифугирования раствор над уплотненным осадком сливают в отдельную емкость для дальнейшего фильтрования. Раствор фильтруют через мембранные фильтры "Владипор" типа МФАС-СПА диаметром 35 мм фильтровальной установкой ПВФ-35/2. С фильтра делают соскоб осадка покровным стеклом в каплю 50%-ного раствора глицерина и микроскопируют.
4.4. Исследование почвы на личинки гельминтов. Метод Бермана (1942)
Ход исследования. Из объединенной пробы берут 20 г почвы и помещают на металлическую сетку (или ситечко для молока), которую устанавливают в аппарат Бермана. Последний представляет собой стеклянную воронку (диаметром 10 - 15 см), соединенную при помощи резиновой трубки с узкой пробиркой. Систему устанавливают в штатив, наполняют теплой (температура 45 - 50 °C) водой, а затем металлическую сетку с почвой помещают в воронку так, чтобы нижняя часть ее соприкасалась с водой. Воронку с почвой ставят в термостат при температуре 37 °C. Личинки гельминтов, обладая термотропностью, мигрируют из почвы через сито в теплую воду и оседают на дно пробирки. Через 3 - 4 часа осторожно отсоединяют пробирку от воронки, сливают верхний слой жидкости, а осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют. Но лучше содержимое пробирки центрифугировать, а после этого исследовать осадок.
4.5. Исследование почвы на личинки гельминтов. Метод Супряга
Ход исследования. В химический стаканчик помещают 10 г почвы, заливают теплым (40 °C) физиологическим раствором так, чтобы он полностью покрывал пробу. Через 20 мин. жидкость сливают в чашку Петри и исследуют под стереоскопическим бинокулярным микроскопом. По эффективности метод Супряга не уступает методу Бермана.
4.6. Дифференциальная диагностика личинок свободноживущих и паразитических нематод. Метод Корта
Принцип метода Корта заключается в воздействии на личинок нематод формалином. При этом личинки свободноживущих нематод погибают быстрее, чем паразитические. Личинки помещают в воду в чашку Петри или на часовое стекло. При добавлении 40%-ного раствора формалина к жидкости с личинками нематод в соотношении 1:5 личинки свободноживущих нематод гибнут через 5 - 8 мин., а паразитические остаются живыми в течение 15 - 20 мин., но подвижность их замедляется; при добавлении формалина в соотношении 1:25 первые гибнут через 12 мин., тогда как вторые в 95% случаев остаются нормально подвижными.
4.7. Исследование почвы на цисты кишечных простейших. Метод Падченко (1992)
Ход исследования. Из объединенной пробы берут 25 г почвы, помещают в фаянсовую ступку, постепенно добавляют к ней водопроводную воду, тщательно растирают пестиком до гомогенной кашицы и выливают ее в цилиндр емкостью 1 л, предварительно наполненный на 3/4 объема чистой водой. Смесь размешивают стеклянной палочкой и отстаивают в течение 15 мин. Образовавшуюся на поверхности смеси пленку удаляют петлей, а жидкую часть ее отсасывают сифоном в чистый цилиндр. Осадок повторно промывают (не менее 3-х раз), собирая промывные воды в одном цилиндре. Промывные воды отстаивают, через 24 ч надосадочную жидкость удаляют сифоном, а осадок исследуют в окрашенных раствором Люголя препаратах. С этой целью осадок тщательно встряхивают и одну каплю полученной взвеси наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под световым микроскопом. Микроскопируют не менее 1 мл осадка с последующим пересчетом на его общий объем. Анализ осадка проводят в течение первых 2 - 3 суток после его получения. Для того чтобы осадок длительное время оставался пригодным к исследованию (до 2-х месяцев), к нему добавляют консервант, содержащий мертиолят 0,0016 - 0,0018 г, 40%-ный раствор формалина, 10,4 - 0,9 г 96%-ного этилового спирта и физиологический раствор до 100 мл. Консервант добавляют к осадку в соотношении 1:2 и хранят в холодильнике. Для приготовления мазков каплю исследуемой смеси осадка с консервантом после встряхивания наносят пипеткой на предметное стекло, смешивают ее с каплей акридинового оранжевого, разведенного 1:500, накрывают покровным стеклом и исследуют под световым или люминесцентным микроскопом, подсчитывают число неокрашенных (живых) и окрашенных (мертвых и дегенерирующих) цист кишечных простейших каждого вида. При изучении исследуемого материала под световым микроскопом жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а дегенерирующие и мертвые цисты окрашиваются в желтый цвет. Погибшие цисты под люминесцентным микроскопом полностью прокрашиваются и имеют красный цвет. Жизнеспособные накапливают краску на поверхности цисты и имеют вид светящихся колец красного цвета.
5. Исследование воды
5.1. Исследование воды питьевого и хозяйственно-бытового назначения, в том числе воды плавательных бассейнов и аквапарков
Исследование воды регламентируется методическими указаниями МУК 4.2.1884-04 "Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов" и МУК 4.2.2314-08 "Методы санитарно-паразитологического анализа воды".
6. Исследование бытовых и ливневых стоков
6.1. Отбор проб, транспортировка, хранение и подготовка к исследованию
Пробы сточных вод отбирают на входе и выходе с очистных сооружений (механическая очистка, аэро- и биостанции, компактные установки, биологические пруды, поля фильтрации), на полях орошения и в местах сброса их в поверхностные водоемы. Количество сточных вод на одну пробу должно быть не менее: неочищенной (до поступления на очистные сооружения) - 1 л, после сооружений механической очистки - 3 л, в остальных случаях - 10 л. Отбор проб сточных вод проводят в резиновых перчатках при помощи емкостей 200 - 500 мл. Отдельные порции сточных вод сливают в широкогорлые пластиковые или стеклянные емкости соответствующего объема. При определении эффективности работы очистных сооружений по паразитологическим показателям следует строго соблюдать следующее правило: после отбора проб входящей на очистные сооружения сточной воды, последующие пробы отбирают с учетом времени ее нахождения на каждом этапе очистки, т.е. после первичных отстойников - через 2,5 ч, аэротенков - 8,5 ч, вторичных отстойников - 10,5 ч, хлораторной - через 11 ч. При определении роли дождевого или паводкового стоков в обсеменении поверхностных водоемов яйцами гельминтов и цистами кишечных простейших пробы их отбирают из естественных водотоков во время дождей по окраинам населенных пунктов или в местах перед их попаданием в водоемы. Пробы воды отбирают отдельными порциями (кружками или банками) по 0,5 л из движущегося потока в широкогорлую стеклянную или пластиковую посуду с крышкой. Объем пробы - 1 л. Можно отбирать пробы поверхностного стока и другим способом. По основным водотокам устраивают так называемые "ловушки" - ямы размером 0,5 x 0,5 x 0,1 м. Во время дождя в них происходит накопление воды поверхностного стока, из которой и отбирают пробы. При этом отбирают как воду - во флаконы, так и поверхностный слой почвы (0,1 - 1,0 см) - в пластиковые пакеты (200 г на пробу). Пробы этикетируют, регистрируют в журнале и доставляют в лабораторию, где их хранят в прохладном месте не более суток. В этикетке обязательно разборчиво указывается фамилия и должность отборщика пробы и представителя учреждения, на территории которого отбирались пробы.
6.2. Исследование сточной воды на яйца гельминтов. Метод Романенко (1996)
Ход исследования. В каждую пробу сточных вод добавляют один из следующих коагулянтов: сульфат алюминия, сульфат железа, сульфат меди в дозе 0,5 - 0,6 г/л и тщательно размешивают. Полное осветление стоков наступает через 40 - 50 мин. После слива надосадочной жидкости осадок помещают (равномерно распределяя) в пробирки объемом 100 - 250 мл и центрифугируют в течение 3 мин. при 1000 об./мин. Воду сливают, а к осадку добавляют 2 - 4 мл 3%-ного раствора соляной кислоты для растворения хлопьев коагулянта. Смесь размешивают и центрифугируют, жидкость сливают, а осадок обрабатывают по методике Романенко для исследования почвы. Для облегчения доставки проб сточных вод и сокращения времени на ее первичную обработку внесение коагулянта можно производить сразу после доставки сточной воды в лабораторию. Коагулянт можно добавлять в сосуд для сбора проб до отбора проб, коагуляция начинается сразу же после заполнения посуды водой. В этом случае в лабораторию доставляют только осадок сточных вод, который и обрабатывают. Эффективность метода составляет 82 - 91%, в среднем - 86%.
6.3. Исследование сточной воды на цисты кишечных простейших. Метод Падченко (1992)
Ход исследования. Пробы сточной воды отстаивают в течение 12 - 16 ч, затем надосадочную жидкость сливают, осадок переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин. при 1000 об./мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок переносят на предметное стекло, добавляют консервант (п. 4.7) и исследуют под световым или люминесцентным микроскопом. Жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются в составе этих консервантов неокрашенными. Дегенерирующие цисты окрашиваются красителем в фиолетовый цвет. Эффективность метода в среднем 90%.
7. Исследование донных отложений и осадка сточных вод
7.1. Отбор проб, транспортировка, хранение и подготовка к исследованию
Пробы донных отложений отбирают в поверхностных водоемах выше, ниже и непосредственно в месте сброса в них сточных вод, их осадков, навозных стоков, а также в местах водозабора и попадания стоков с поверхности территорий населенных пунктов, индивидуальных и фермерских хозяйств. Для отбора проб применяют различные системы пробоотборников: дночерпатели, драги и трубки различных конструкций. Отбор проб донных отложений ручным или механизированным способом проводят с берега или с различных плавсредств. Пробы объемом 200 г помещают в широкогорлые стеклянные или пластиковые емкости с крышками, этикетируют, регистрируют в журнале и доставляют в лабораторию, где их хранят в холодильнике. Требования к этикетированию такие же, как и к пробам почвы и воды (см. выше). Пробы "сырых" (97 - 98% влажности) осадков сточных вод из первичных и вторичных отстойников, а также с иловых площадок очистных сооружений берут с помощью черпака или кружки отдельными порциями по 100 - 200 мл и сливают в широкогорлые стеклянные или пластиковые сосуды объемом 1 л с притертыми или завинчивающимися крышками. Пробы обезвоженных (до 70% влажности) осадков сточных вод берут совком или лопатой навесками по 50 г с 4 - 5 мест иловых площадок (2 - 3-летнего выдерживания осадка), компостных буртов, объедин
|
