Студопедия — Использование обратной транскриптазы
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Использование обратной транскриптазы






Задача синтеза гена значительно упростилась с открытием фермента обратной транскриптазы, обнаруженной впервые у РНК-содержащих ретровирусов. Ретровирусы используют обратную транскриптазу для синтеза ДНК-овой копии собственной РНК. Образующаяся при этом двухцепочечная молекула ДНК может легко интегрироваться в геном клетки-хазяина. В 1970 г. Темин и Митузани и независимо от них Балтимор выделили данный фермент из препарата внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. По механизму действия этот энзим является РНК-зависимой ДНК-полимеразой, но чаще используются его тривиальные названия – обратная транскриптаза или ревертаза.

Обратная транскриптаза обладает по крайней мере тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) Активностью РНК-азы Н, гидролизующей цепь РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза очевидно участвует в интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина.

В генной инженерии обратную транскриптазу используют для получения ДНК-овой копии гена, если удается выделить из донорной клетки соответствующую гену m-РНК (матричную, информационную РНК).

Синтез гена с помощью ревертазы ведут таким образом: сначала в систему вводят m-РНК, набор ДНК-овых нуклеотидов, небольшие затравки для синтеза – праймеры – олиго (dT) и обратную транскриптазу, которая начинает синтезировать на матрице m-РНК комплементарную цепь ДНК; затем с помощью щелочного гидролиза удаляют m-РНК, а обратная транскриптаза «делает разворот», и используя только что образованную цепь ДНК как матрицу, синтезирует на ней еще одну комплементарную цепь. Для ускорения синтеза второй цепи ДНК на этой стадии иногда добавляют ДНК-полимеразу I E. coli, которая дублирует полимеризующую активность ревертазы. По окончании синтеза первая и вторая цепи ДНК оказываются связанными петлей в виде шпилечной структуры. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S 1, которая способна специфически гидролизовать одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. В результате получают полноценную ДНК-овую копию гена, которую можно легко встроить в вектор и ввести в клетку-реципиента.

Однако при использовании ревертазы есть свои сложности. Так, m-РНК не содержит регуляторных участков (промоторов и терминаторов), что вызывает необходимость достраивать их в векторе. Кроме того, выделить m-РНК в чистом виде достаточно сложно.

Метод дробовика (дробового ружья)

При невозможности синтезировать ген химическим путем или с помощью обратной транскриптазы используют технику Shot-gun – метод дробового ружья. Суть его заключается в том, что сначала ДНК дробят на фрагменты с помощью рестриктаз, то есть создают библиотку генов или фрагментов ДНК. Полученные ДНК-овые фрагменты гибридизируют «вслепую» с вектором, разрезаным той же рестриктазой. Гибридные векторы, содержащие встроенный ген методом трансформации переносят в бактерии (обычно в кишечную палочку) и размножают. Затем идентифицируют и отбирают необходимые колонии одним из перечисленных ниже методов (см. IV этап). Способ отбора на селективных средах осуществляют с помощью генетических маркеров – способности расти на средах с антибиотиком, если ген несет фактор устойчивости, неспособности расти на средах с антибиотиком, если ген устойчивости к этому антибиотику инактивирован путем встройки в него гибридного фрагмента (при этом используется метод реплик), способности расти на средах без ауксина, если в геном ауксотрофа по этому ауксину введен нужный ген. Если же соответствующий генетический маркер не найден, используют метод гибридизации.

 







Дата добавления: 2015-08-12; просмотров: 1514. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Кардиналистский и ординалистский подходы Кардиналистский (количественный подход) к анализу полезности основан на представлении о возможности измерения различных благ в условных единицах полезности...

Обзор компонентов Multisim Компоненты – это основа любой схемы, это все элементы, из которых она состоит. Multisim оперирует с двумя категориями...

Композиция из абстрактных геометрических фигур Данная композиция состоит из линий, штриховки, абстрактных геометрических форм...

Важнейшие способы обработки и анализа рядов динамики Не во всех случаях эмпирические данные рядов динамики позволяют определить тенденцию изменения явления во времени...

Условия приобретения статуса индивидуального предпринимателя. В соответствии с п. 1 ст. 23 ГК РФ гражданин вправе заниматься предпринимательской деятельностью без образования юридического лица с момента государственной регистрации в качестве индивидуального предпринимателя. Каковы же условия такой регистрации и...

Седалищно-прямокишечная ямка Седалищно-прямокишечная (анальная) ямка, fossa ischiorectalis (ischioanalis) – это парное углубление в области промежности, находящееся по бокам от конечного отдела прямой кишки и седалищных бугров, заполненное жировой клетчаткой, сосудами, нервами и...

Основные структурные физиотерапевтические подразделения Физиотерапевтическое подразделение является одним из структурных подразделений лечебно-профилактического учреждения, которое предназначено для оказания физиотерапевтической помощи...

Стресс-лимитирующие факторы Поскольку в каждом реализующем факторе общего адаптацион­ного синдрома при бесконтрольном его развитии заложена потенци­альная опасность появления патогенных преобразований...

ТЕОРИЯ ЗАЩИТНЫХ МЕХАНИЗМОВ ЛИЧНОСТИ В современной психологической литературе встречаются различные термины, касающиеся феноменов защиты...

Этические проблемы проведения экспериментов на человеке и животных В настоящее время четко определены новые подходы и требования к биомедицинским исследованиям...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.01 сек.) русская версия | украинская версия