Ферменты в генной инженерии:

Ферменты, применяемые в генетической инженерии, можно разделить на четыре основные группы:

•ферменты, фрагментирующие НК;

•ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК;

•ферменты, лигирующие фрагменты ДНК;

•ферменты, модифицирующие концы НК.

Нуклеазы. Могут разрезать НК с образованием 3’- гидроксильной или 5’- гидроксильной группы

ДНКазы

1) Эндонуклеазы- М.б. специфичными к одноцепочечным или двухцепочечным ДНК

2) Экзонуклеазы

-5’® 3’-экзонуклеазы

-3’® 5’-экзонуклеазы

РНКазы Н - Расщепляют РНК в составе гибрида ДНК-РНК. Бывают эндонуклеазы или 3’® 5’-экзонуклеазы. Активностью РНКазы Н обладает обратная транскриптаза

Рестриктазы. входит в состав системы рестрикции-метилирования бактерий. Система рестрикции-метилирования служит для защиты бактерий от вирусов. Рестриктазы и метилазы специфичны к первичной структуре ДНК. Метилазы метилируют ДНК. Рестриктазы разрезают ДНК

Фосфатаза - гидролизует 3’- или 5’- фосфомоноэфиры.

Полинуклеотидкиназа - фосфорилирует 5’-концевые гидроксильные группы ДНК и РНК, но не фосфорилирует 3’-гидроксильные группы; используется для мечения 5’- конца полинуклеотидной цепи с помощью радиоактивного Р-32 в составе АТФ

ДНК-лигаза - катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. ДНК-лигаза фага Т4 или E.coli катализируют реакции

ДНК-полимераза I - требует для работы матрицу и затравку, обладает полимеразной и 5’® 3’- и 3’® 5’-экзонуклеаз-ными активностями ДНК-полимераза I - способна заполнять брешь, ревращать липкие концы в тупые

Обратная транскриптаза - требует затравку

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза - не нуждается в матрице, но требует затравку.

Поли-А-полимераза - присоединяет поли-А к РНК, в качестве субстрата использует АТФ

 

49. Генная инженерия бактерий.

-выделение или синтез гена,-введение чужеродного гена в вектор,-введение химерного вектора в бактериальную клетку,-размножение бактерий, -выделение и очистка синтезированного чужеродного белка

ВЫДЕЛЕНИЕ И СИНТЕЗ ГЕНА

-Выделение матричной РНК и синтез кДНК

-Выделение гена из библиотеки генома

-Синтез гена по известной первичной последовательности ДНК или белка

-Синтез гена с помощью ПЦР

-Введение чужеродного гена в вектор
Получение химерных векторов1) на основе плазмид с использованием рестриктаз. 2)на основе плазмид с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. 3)на основе плазмид с использованием лигазы, сшивающей ДНК по тупым концам.

Плазмиды могут нести гены устойчивости к антибиотикам. Используют плазмиды с двумя генами устойчивости к антибитикам. Сайт встраивания чужеродной ДНК в плазмиду находится в одном из генов устойчивости к антибиотикам. Второй ген обуславливает способность бактерии, имеющий эту плазмиду, существовать в среде в присутствии антибиотика.

ВВЕДЕНИЕ ХИМЕРНОГО ВЕКТОРА В БАКТЕРИАЛЬНУЮ КЛЕТКУ - Рекомбинантными плазмидами обрабатывают бактериальные клетки. Обработку проводят в среде в присутствии ионов кальция, через раствор пропуская короткие импульсы тока

При выращивании клеток в среде в присутствии антибиотика бесплазмидные клетки погибнут. Бактерии с рекомбинантной и нерекомбинантной плазмидами будут расти на среде в присутствии указанного антибиотика. Бактерии с рекомбинантной плазмидой будут чувствительны к другому антибиотику. На основании чувствительности к антибиотикам отбирают клоны бактерий с рекомбинантной плазмидой. Бактерии с рекомбинантной плазмидой размножают.

В генетической инженерии широко используют плазмиды, несущие ген устойчивости к антибиотику и ген бета-галактозидазы. Бета-галактозидаза опредяляет голубой цвет колоний. Встраивание чужеродной ДНК осуществляют в ген бета-галактозидазы. Бактерии содержащие рекомбинантную плазмиду будут расти в присутствии антибиотика и будут при этом бесцветными. Бактерии содержащие нерекомбинантную плазмиду будут расти в присутствии антибиотика и будут при этом голубыми. Бесплазмидные бактериальные клетки в присутствии антибиотика погибнут. Для экспрессии чужеродных генов необходимо, чтобы перед геном располагались бактериальный промотор и регуляторные участки.

Плазмиды бывают:

-однокопийными (одна копия на клетку)

-мультикопийные (обычно 10-20 копий на клетку

-плазмиды с ослабленным контролем репликации (могут накапливаться в клетке до 1000 копий)

В качестве векторов используют:

1. Фазмиды – искусственные гибриды между фагом и плазмидой.

Фаг + плазмида = фазмида

Фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других как фаги

2. Челночные плазмиды содержат последовательности ДНК, позволяющие существовать как в бактериальных клетках, так и в дрожжах

Векторы на основе фага l: фаг l - 48502 п.н.