ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Основным результатом работы к данному этапу с использованием схемы, является 1) выделение чистой культуры бактерий, 2) описание ее культуральных свойств, 3) четкое и достоверное отнесение составляющих ее клеток к грамотрицательным или грамположительным.

Проведенное определение анатомических особенностей бактерий будет весьма полезным и необходимым на этом этапе, и, в совокупности с биохимическими особенностями, позволит идентифицировать выделенные бактерии.

Используемые для идентификации тесты весьма разнообразны, некоторые из них необходимы для идентификации многих групп бактерий, в других случаях их постановки не требуется. Постановка биохимических тестов требует особенной тщательности и внимания при приготовлении используемых сред, постоянного контроля за чистотой выделенной и идентифицируемой культуры, повторения (независимого) каждого теста не менее 2-х раз, использования при постановке тестов культур с заведомо положительной и отрицательной реакцией. Учет результатов при постановке физиолого-биохимических тестов проводится в течение 24-96 часов (если нет особых указаний).

Определение роста при различных температурах. Интенсивность роста определяется в интервале температур от 4 до 60⁰ С. Для этого на агаризованную среду в чашках Петри проводят посев исследуемых культур до изолированных колоний и помещают в соответствующие условия. Оптимальную температуру роста определяют визуально а зависимости от скорости появления одиночных колоний.

Определение каталазы. Каплю перекиси водорода (3% раствор) наносят на предметное стекло и вносят туда же петлю исследуемой культуры. В присутствиии каталазы образуются пузырьки водорода. Каплю перекиси водорода можно наносить непосредственно на колонию и следить за выделением газа. В качестве положительного контроля могут быть использованы штаммы Pseudomonas sp., отрицательного – Agrobacterium sp. Некоторые бактерии, например молочнокислые, на средах, не содержащих глюкозу или с ее низкими концентрациями, образуют негемовую «псевдокаталазу». Образование «псевдокаталазы» можно предотвратить введением в среду глюкозы до концентрации 1%.

Определение оксидазы. Пробу ставят с 1% раствором тетраметил-парафенилендиамина гидрохлорида (можно использовать диметилпарафенилендиамин гидрохлорид). Раствор реактива нестоек, его используют свежеприготовленным. На 18-24 часовую культуру на чашке наливают несколько капель реактива и, наклонив чашку, дают ему стечь. Через 20-30 сек колонии микроорганизмов, обладающих оксидазой, приобретают пурпурную окраску. Можно снять колонию с чашки и растереть ее на предметном стекле в капле реактива. В этом случае окрашиваться в красный цвет будет капля. Важно, что колонию в этом случае нужно снимать стеклянной палочкой или запаянным концом пастеровской пипетки. Оксидазоположительными являются штаммы Pseudomonas sp., оксидазоотрицательными – Escherichia sp.

Определение активности пероксидазы (бензидиновый тест). На предметное стекло (4-6 капель) или в пробирку (2 мл) вносят суточные культуры бактерий, затем приливают 1 или 3 капли 2 % раствора метил-пара-аминофенол сульфата (метол) и такое же количество 3 % раствора перекиси водорода и наблюдают за изменением окраски. В зависимости от концентрации клеток (10⁷ – 10⁶) через 5 – 10 мин. бесцветная среда приобретает розовую или вишнево-красную окраску. Такая положительная реакция характерна для Staphylococcus sp., отрицательная - Pseudomonas sp., Escherichia sp.

Отношение микроорганизмов к кислороду. Исследуемую культуру уколом бактериологической иглы засевают в пробирки с высоким столбиком агара (не менее 2/3 по высоте). Расплавленный и разлитый в пробирки агар быстро охлаждают под струей холодной воды и засевают уколом культуру микроорганизмов. После культивирования отмечают характер роста: если на поверхности среды - исследуемые микроорганизмы относятся к аэробам; если только в глубине или на дне столбика агара - к облигатным анаэробам, равномерный рост по всему уколу указывает, что выросшие микроорганизмы - факультативные анаэробы, на некотором расстоянии от поверхности - на их принадлежность к микроаэрофилам.

В среду может быть внесен восстанавливающий агент для снижения окислительно-восстановительного потенциала. В качестве последнего может быть использован тиогликолат натрия (концентрация 0,05 %) или цистеин HCl (0,025 %), которые добавляются в среду перед автоклавированием. Приготовленные среды долго не хранят, исключается их хранение в холодильнике.

Окислительное или ферментативное образование кислоты из углеводов (тест Хью-Лейфзона, O/F тест). Готовится среда следующего состава (г/л): пептон ферментативный -2, NаС1 -2, К₂НР0₄ - 0,3, агар – 0,5 %, рН - 7,2. Автоклавируется при 0,5 атм 20-25 мин. Отдельно стерилизуются 10% водные растворы углеводов, которые вносят в среду перед использованием из расчета 10 мл на 100 мл среды. Также после автоклавирования вносят один из индикаторов, например, бромтимоловый синий - 3 мл 1% раствора. В таблице 1 Приложения приведены примеры наиболее часто употребляемых рН-индикаторов и диапазоны рН, в которых они используются. При подборе индикатора следует убедиться, что он не подавляет рост микроорганизма. Все индикаторы плохо растворимы в воде и используются в средах очень низких концентрациях.

Среду разливают по пробиркам. Исследуемые культуры засевают параллельно в 2 пробирки, одна из которых заливается стерильным вазелиновым маслом. Результаты регистрируются ежедневно. Организмы, сбраживающие сахар (отрицательный оксидазный тест, F-реакция, Escherichia sp.), образуют кислоту в обеих пробирках. Об этом судят по изменению окраски индикатора. Микроорганизмы с окислительным типом метаболизма (оксидазоположительные, О-реакция, Pseudomonas sp.) образуют кислоту только в открытой пробирке. Кислота образуется вначале только в верхней части среды. Если кислота не образуется ни в одной из пробирок, бактерии не катаболизируют углевод, если рост вообще отсутствует, возможно, в среде нет какого-либо питательного вещества, необходимого для роста.

Определение сахаролитических ферментов. Используются дифференциально-диагностические среды Гисса: в дистиллированную воду добавляют 1% пептона, 0,5% NаС1, 1 % K₂HPO₄ и индикатор (например, Андреде 1% или бромкрезоловый пурпурный 1,6% в количестве 0,01 мл на 100 мл среды Гисса), рН 7,2. Добавляют исследуемый углевод до конечной концентрации 0,5-1,0 %. Среду уплотняют добавлением 0,5 % агара. Стерилизуют 15 мин при 0,5 атм. Образование кислоты отмечают по изменению цвета индикатора, образование газа – по появлению пузырьков или разрывов в толще среды.

Определение способности кислотообразования и продукции ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра). Используется среда Кларка: к 80 мл дистиллированной воды добавляют по 0,5 г пептона, глюкозы и К₂НРО₄, подогревают и после охлаждения фильтруют через бумажный фильтр. Доводят объем до 100 мл, разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют 15 мин при 0,5 атм.

Для определения способности кислотообразования (уменьшение рН ниже 5), после 4-х суточного роста культуры в этой среде в нее прибавляют 3-5 капель 0,04% раствора метилового красного (1 мл 1,6% спиртового раствора метилового красного и 39 мл спирта, раствор сохраняется неограниченное время). При сильном кислотообразовании получается красное окрашивание, при слабом - желтое.

Для определения продукции ацетилметилкарбинола ставят реакцию Фогес-Проскауэра. К 4-5 суточной культуре на вышеописанной среде добавляют равный объем 10% КОН и выдерживают при 37°С. Через 18-24 часа в результате образования ацетилметилкарбинола на глюкозе среда окрашивается в розовый цвет с желтым оттенком, что оценивается как положительный результат. Отсутствие изменений в окраске рассматривается как отрицательный результат (т.е.образуется ацетоин и 2,3-бутиленгликоль). Применение 20% раствора КОН позволяет оценивать результаты через 4 часа. Бактерии кишечной группы характеризуются различным результатом при постановке данной реакции.

Рост на среде с тремя сахарами и железом используется приидентификации представителей семейства Enterobacteriaceae. В состав среды входит: пептон (%) – 2, глюкоза – 0,1, лактоза – 1 %, сахароза – 1 %, железо(II)-аммонийсульфат – 0,02 %, NaCl - 0,5, Na₂S₂0₃ (тиосульфат) – 0,03, феноловый красный – 0,0025 %, агар – 1,5. После автоклавирования среду разливают как скошенный агар с высоким столбиком в основании. Посев производится на поверхность скошенного агара, а также бактериологической иглой глубоко в столбик. В процессе инкубации определяют: 1) кислотно-щелочную реакцию на поверхности скошенного агара (аэробные условия); 2) кислотно-щелочную реакцию в столбике (анаэробные или микроаэрофильные условия); 3) газообразование H₂, CO₂ (газовые полости или разрыв столбика; 4) образование H₂S (почернение за счет сульфида железа). Бактерии, использующие и глюкозу и лактозу (E.coli), дают кислую реакцию и в столбике и в скошенном агаре. Не сбраживающие лактозу штаммы, дают кислую реакцию в столбике и щелочную на скошенном агаре. Образование H₂S фиксируют по почернению среды.

Образование индола. К бульонной (или выращенной в пептонной воде) культуре микроорганизмов добавляют 2-3 капли 30 % серной кислоты и осторожно пастеровской пипеткой по стенке наслаивают раствор азотнокислого натрия (0,05 %). При ферментации культурой триптофана до индола на границе раздела жидкостей появляется розовое кольцо.

Существует и менее чувствительный метод постановки реакции, который заключается в использовании индикаторных бумажек, пропитанных щавелевой кислотой (метод Морелли). Для приготовления индикаторных бумажек 12 г щавелевой кислоты растворяют в 88 мл дистиллированной воды при подогревании. Индикаторные бумажки пропитывают, высушивают при 37⁰ С хранят в темноте. Такую индикаторную бумажку помещают в пробирку с растущей культурой бактерий, инкубируют и учитывают результаты. При образовании индола (бактерии Escherichia coli) бумажка становиться розово-красной. Если индол не образуется (Enterobacter aerogenes), то сохраняется серовато-белая окраска бумажки.

Образование сероводорода. Готовят среду следующего состава (г/л): пептона -10. СаС1₂ - 5,0, лимонно-аммиачного железа - 0,3, агара - 1,5%, дрожжевого экстракта (10 %) - 2 мл, вода водопроводная, рН 7,0. Стерилизуют 15 мин при 0,5 атм. Исследуемые культуры засевают на поверхность скошенного агара. О выделении сероводорода судят по почернению среды.

Для определения продукции сероводорода можно использовать индикаторные бумажки, пропитанные раствором уксуснокислого свинца. При образовании сероводорода наблюдается ее почернение, при отрицательной реакции – серовато-белый цвет не изменяется.

Разжижение желатина. К жидкой полноценной среде добавляют 12-15 % желатина, растворяют. После стерилизации (15 мин при 0,5 атм), разливают в пробирки по 5 мл. При наличии протеолитических ферментов (Proteus vulgaris) наблюдается разжижение столбика желатины.

Определение казеинолитической активности на молочных питательных средах. Для приготовления среды смешивают равные объемы 3 % минимального агара и 5 % обезжиренного молока. Заливают в чашки Петри и засевают исследуемые культуры штрихом. Гидролиз казеина фиксируют по появлению зон просветления вокруг роста культуры. Для получения более четкой зоны просветления среду можно обработать 10 % раствором соляной кислоты.

При использовании жидкой среды (5 % обезжиренное молоко), культуру засевают петлей и суспендируют. Учет результатов проводят через 12 и 18-24 часа с учетом следующих феноменов: 1) свертывание, в результате которого образуются сгустки казеина (при наличии газообразования сгусток может всплывать на поверхность; 2) пептонизация (лизис казеина), при котором молоко становится прозрачным. Обе реакции могут происходить последовательно или одновременно. При отрицательной реакции молоко остается без изменений.

Определение амилолитической активности. Для определения используют полноценную среду, дополненную 0,2 % растворимым крахмалом. После появления роста засеянных бактерий, чашки обрабатывают раствором Люголя. Фиксируют наличие зон просветления вокруг колоний, свидетельствующих о разложении крахмала (Bacillus subtilis).

Определение лецитиназной активности. Готовят яично-желточную плотную среду: к 300 мл стерильного МПА, расплавленного и охлажденного до 45-50° С, добавляют 1 желток куриных яиц. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри, которые в последующем используют для работы. Исследуемые культуры засевают медальонами в чашки и наблюдают за характерными изменениями среды. При положительной реакции, например, (стафилококки, клостридии), на агаре появляется зона просветления, а на поверхности среды вокруг колонии формируется небольшой ореол, отливающий металлически блеском. При отрицательной реакции агаровая среда вокруг колоний не изменяется.

Обнаружение дегидрогеназной активности у колоний бактерий. Бактерии выращивают на полноценной среде с добавлением дрожжевого экстракта в течение 2-3 суток. На выросшие колонии наливают слой охлажденного 1,5 % агара в количестве 15 мл, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,0). Для получения буферного раствора сливают 7 частей раствора А (11,9 г Na₂HPO₄ в 1 л дистиллированной воды) и 3 части раствора Б. (9,1 г К₂НР0₄ в том же объеме воды). В верхний слой вносят раствор 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида в количестве 0,1%. Чашки выдерживают в течение 3 часов. О наличии дегидрогеназной активности судят по появлению красной окраски колоний, обусловленной образованием формазанов.

Определение активности декарбоксилаз осн о вных аминокислот (аргинин, лизин, орнитин, гистидин, тирозин, глутаминовая и гамма-аминомасляная). Бактерии выращивают в среде, содержащей (г/л): пептон - 5, мясной экстракт - 5, бромкрезоловый пурпурный 1,6% раствора - 0,625 мл, крезоловый красный 0,2% раствора - 2,5 мл, глюкоза - 0,5 г, пиридоксаль - 0,5. Вещества смешивают в указанном порядке. При необходимости добавляют (до 1 %) растворы следующих аминокислот: лизина, аргинина или др. аминокислот, рН среды - 6,0. Каждую из используемых сред разливают в 2 пробирки по 3-4 мл. Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Исследуемой культурой параллельно засевают 2 пробирки. В одной из пробирок создают анаэробные условия путем добавления (после засева!) 4-5 мл стерильного вазелинового масла. Культивируют I-7 дней, результаты учитывают ежедневно. При наличии декарбоксилазной активности среда подщелачивается за счет образования диаминов, вызывая изменение окраски индикатора от желтой до фиолетовой или красновато-фиолетовой.

Дезаминирование фенилаланина. Основная среда (г/л): дрожжевой экстракт - 3, фенилаланин – 2, Na₂HPO₄ - I, NаС1 - 5, агар - 12. Среда стерилизуется при 0,5 атм 15 мин. Посев производится на длинно скошенную среду с плотной агаризованной. Время инкубирования - 2-10 дней. После инкубирования на колонии наносится 4-5 капель 10% раствора хлорного железа (FeCl₃). Если произошло дезаминирование фенилаланина до фенилпировиноградной кислоты (Proteus vulgaris), то появляется зеленая окраска, в противном случае (Escherichia coli) цвет среды (слегка желтоватый) не изменяется.

При замене фенилаланина на триптофан при регистрации результатов, развивается коричнево-красная окраска.

Определение аргининдегидролазной активности. Исследуемые бактерии выращивают на среде следующего состава (в %): пептон - 0,5, мясной экстракт -0,5, глюкоза - 0,05, пиридоксаль - 0,0005, исследуемая аминокислота -1,0, рН 6,0. На 100 мл среды добавляют крезолового красного - 0,2 мл (0,2 % раствора), бромкрезолового пурпурного - 0,5 мл (0,2 % раствора). В случае положительной реакции цвет среды культивирования изменяется от серо-синего к сине-фиолетовому.

Определение окисления глюконата калия. Реакцию проводят в среде следующего состава (в %): глюконат калия –1; NaCl – 0,55; (NH₄)₂SO₄ – 0,050; KH₂PO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,01. В пробирку с 1 мл среды вносят микробную культуру с плотной среды. Засеянные пробирки помещают в термостат (37 ⁰ С) на 6 час. Затем в каждую пробирку приливают 3 мл 1 % раствора молибдата аммония и 0,2 мл ледяной уксусной кислоты. Пробирки встряхивают и кипятят на водяной бане 5 мин. с последующим резким охлаждением. При положительной реакции (Pseudomonas sp.) появляется темно-синяя окраска.

Ассимиляция азота минеральных солей. Готовят основную среду (г/л): глюкоза -20, К₂НРО₄ -1,0, МgSO₄ - 0,5, NaCl - 0,5, агар -15, рН - 7,1-7,2. В одном случае в среду вносят NH₄Cl - 1,0, СаСО₃ - 5,0, в другом – KNO₃ -1,0. Стерилизуют при 0,5 атм и готовят скошенный агар, на который осуществляют посев исследуемой культуры.

Ассимиляция молекулярного азота. Определяют на безазотистой среде Эшби (г/л): маннит - 20, К₂НР0₄ - 0,2 MgSO₄ -. 0,2, NаС1 - 0,2, K₂SO₄ - 0,1, СаСОз - 5,0, агара -15. рН 7,1-7,2. Стерилизуют при 0,5 атм, готовят скошенный агар, посев на который производят штрихом.

Определение наличия нитратредуктазы с использованием реактива Грисса. К исследуемой микробной культуре (18-24 час) на скошенном агаре приливают 1-2 мл физиологического раствора, диспергируют. В опытную и контрольную пробирку вносят по 1 мл микробной суспензии и к ней добавляют 0,1 мл азотнокислого натрия или калия (10 % раствора). Можно использовать указанные соли в виде порошка (в этом случае вносят несколько кристалликов селитры). Пробирки инкубируют в течение 1 часа при 37° С. Затем в каждую пробирку вносят по 1 мл (1 % раствора) реактива Грисса. Учитывают реакцию на нитриты: в течение 1 мин. появляется вишнево-красное окрашивание, которое может немедленно измениться до желтого при наличии их большого количества.

Определение нитритредуктазы с использованием реактива Грисса. Суточную микробную культуру, выращенную на скошенном агаре, смывают 0,02 % раствором азотистокислого калия или натрия, приготовленного на физиологическом растворе и простерилизованного кипячением. Разливают по пробиркам в объеме 1-2 мл и выдерживают в термостате в течение часа. После этого в пробирки добавляют равный объем реактива Грисса. При разложении нитритов, среда в пробирке остается бесцветной. При отсутствии их редукции, среда приобретает вишнево-красную окраску.

Определение уреазной активности. Реакция проводится на среде с мочевиной, которую готовят следующим образом. Готовят два раствора: 1) А: этанола 96^о 2 мл, дистиллированной воды 4 мл, мочевины 2 г (не стерилизуют, хранят на холоду); 2) Б: КН₂РО₄ - 0,1 г, К₂НРО₄ – 0,1 г, NaCl – 0,5 г, 1 мл 0,2 % раствора фенолового красного, вода дистиллированная - до 100мл. Раствор Б стерилизуют в автоклаве и перед использованием смешивают 1 часть раствора А и 19 частей раствора Б, смесь разливают в микропробирки. Максимальное количество исследуемой культуры вносят в среду и растирают в ней.

Учет результатов проводят после 30-60 минут инкубирования при 37^о С (предварительный) и через 6-12 часов – окончательный по изменению окраски среды. При расщеплении мочевины окраска среды из слабо-желтой переходит в малиново-красную.

Выявление пигментов осуществляют на различных по составу средах: