ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ 4 страница

Подтверждают принадлежность характерных колонной к В. сereus. Для этого микроорганизмы из 5 колоний пересевают на скошенный мясо-пептонный агар и термостатируют при 30⁰С в течение 18-24 ч. Идентификацию проводят по тестам, описанным выше при исследовании клинического материала. При подсчете В. сereus, если в 80 % случаях, т. е. не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост В. сereus, то считают, что все характерные колонии, выросшие в чашке принадлежат к В. сereus. В остальных случаях количество В. сereus определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для изучения морфологических и биохимических свойств. Результаты испытаний пересчитывют на 1 г (см³) продукта.

 

ГЛАВА 9

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Бактерии рода Staphylococcus широко распространены в природе. Представлены неподвижными клетками диаметром 0,5-1,5 мкм. В мазках расположены одиночно, парами или виноградными гроздьями. Основные дифференциальные признаки стафилококков - характерная морфология и положительная окраска по Граму. Температурный оптимум 30-37°С. Факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. На плотных питательных средах колонии обычно не прозрачные, белые или кремовые, иногда от желтых до оранжевых. Каталазоположительные, содержат цитохромы, но обычно оксидазоотрицательные. Проявляют высокую биохимическую активность: восстанавливают нитраты, вырабатывают Н₂S, разлагают мочевину и ферментируют многие углеводы с образованием кислоты.

Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя вирулентность. Погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10-12 часов, устойчивы к нагреванию - при 70-80°С погибают за 20-30 мин, при 150⁰С за 10 мин, сухой жар убивает их за 2 часа. Стафилококки очень устойчивы по отношению к находящемуся в продуктах хлористому натрию, при концентрации NaCl равной 7-10% еще наблюдается их размножение. Сахар не препятствует размножению стафилококков, концентрация его более 60% является задерживающим фактором их роста.

Одним из факторов патогенности стафилококков является наличие фермента коагулазы. По наличию коагулазы все стафилококки разделяют на две группы: коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. Среди коагулазоположительных стафилококков поражение у человека вызывает S.аureus (золотистый стафилококк), который чаще всего может быть причиной пищевого отравления. Коагулазный тест надежный и широко применяемый для предсказания энтеротоксигенности стафилококка, при этом необходимо учитывать, что коагулазоотрицательные стафилококки так же могут продуцировать энтеротоксины и вызывать пищевые отравления.

Факторами патогенности стафилококков, являются энтеротоксины А, В, С_1-2, Д, Е - термостабильные низкомолекулярные белки. Основные продуценты бактерии III фагогруппы. Именно эти токсины ответственны за развитие пищевых отравлений. Наиболее часто регистрируют интоксикации, вызванные энтеротоксинами А и Д. Энтеротоксины выдерживают автоклавирование при 120°С в течение 20 минут. Снижение терморезистентности энтеротоксина связано с рН среды. Так, при рН 4,5, нагревание на кипящей бане в течение 40 минут снижает активность энтеротоксина в 10 раз, а при рН 3,0 энтеротоксин полностью разрушается.

Стафилококковые пищевые отравления проявляются рвотой, болями в животе и водянистой диареей, уже через 2-6 часов после употребления в пищу контаминированных продуктов. Любой вид пищевого продукта может быть причиной этих отравлений, обычно это кондитерские изделия с кремом, мясные и овощные салаты. Стафилококковые отравления часто связаны с консервами (овощными, мясными, рыбными), в них стафилококки обычно попадают с контаминированным сырьем или растительным маслом. При наличии стафилококка в количестве 10⁶ и более в 1г продукта энтеротоксин накапливается за 4-8ч, причем без внешних изменений банок.

Пищевые продукты, вызвавшие пищевые отравления, обычно бывают значительно обсеменены патогенными стафилококками (10⁵-10⁶г (см³)).

Критерии диагностики. Для оценки результатов исследования на стафилококки при пищевых отравлениях имеет значение количественное обсеменение ими пищевых продуктов, обнаружение возбудителя в рвотных массах, промывных водах, испражнениях.

При обнаружении возбудителя в пищевых продуктах количественный учет служит косвенным показателем наличия энтеротоксина, этот показатель следует использовать, учитывая в каждом конкретном случае определенный пищевой продукт, технологию его приготовления, способ и время хранения.

Бактериологические исследования клинического материала.

Первый день. Рвотные массы, промывные воды, испражнения, высевают в количестве 2 капель на поверхность молочно-солевого или желточно-солевого агара (далее ЖСА). Посевной материал равномерно распределяют по поверхности агара стерильным шпателем и втирают досуха. Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 24-48 часов.

На второй день просматривают посевы на чашках с молочно-солевым агаром и ЖСА. На молочно-солевом агаре колонии S.аureus круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными краями, диаметром 2-2,5 мм, окрашены в желтый, золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет. На ЖСА колонии окружены зоной лецитиназной активности (золотистый стафилококк в 60-70% случаев обладет лецитиназной активностью).

Для накопления культуры на скошенный агар отсевают не менее 2-х колоний, подозрительных на стафилококк, и, прежде всего, колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию. Посевы инкубируют при 37⁰С 18-24 ч.

Третий день. У выделенных штаммов проверяют морфологические и тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности. При микроскопии, окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово - синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими скоплениями («кружево»). Плазмокоагулирующую активность определяют в реакции коагуляции плазмы (далее - РКП).

С учетом результатов РКП и лецитовителлазной активности, может быть подтверждена принадлежность выделенного штамма к виду золотистого стафилококка. Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется определение ферментации маннита в анаэробных условиях. Ответ выдают в зависимости от результатов, полученных при определении признаков согласно приложению 27 к настоящей Инструкции.

Тест ферментации маннита в анаэробных условиях. Суточную агаровую культуру засевают уколом в столбик полужидкой среды Гисса с маннитом, на поверхность среды наливают 1,5 мл стерильного вазелинового масла для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 37⁰С, в течении 5 суток, ежедневно просматривают и ведут учет. Положительной считается реакция изменения цвета среды.

Реакция плазмокоагуляции ставится в соответствии с «Инструкцией по применению плазмы кроличьей цитратной сухой», выпускаемой предприятиями по производству бактерийных препаратов. Количественный учет стафилококков выросших при посеве клинического материала не проводят.

Пищевые продукты.

Количество S.аureus в 1 г (см³) продукта определяют методом посева на агаризованные селективно-диагностические среды. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений. 0,1 или 0,2 см³ продукта, или его разведения наносят на поверхность одной из селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агар, молочно-солевой агар, желточно-солевой агар). Преимущественно используют Байрд-Паркер агар. Для посева продукта или каждого его разведения используют две параллельные чашки Петри со средой.

Одновременно производят посев навески продукта или его эквивалентного разведения в среды обогащения (6,0 % солевой бульон и 1 % сахарный бульон). Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:6 или 1:7. При анализе пищевых продуктов с большим содержанием соли проводят посев продука или его разведения в сахарный бульон, во всех других случаях для посева используют солевой бульон. Посевы на агаризованных и жидких средах инкубируют при 37⁰С в течение 48 ч.

Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них после инкубирования делают пересевы на поверхность одной из селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агар, молочно-солевой агар, желточно-солевой агар). Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 24-48 ч.

Просматривают посевы на агаризованных средах и отмечают характер роста. На Байрд-Паркер агаре колонии S.аureus выглядят черными, блестящими, 1,5-2,5 мм в диаметре, окружены зоной лецитиназной активности. Для подсчета количества выросших колоний отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Отмечают рост характерных колоний, отсеянных со сред обогащения, без подсчета их количества.

Для подтверждения принадлежности характерных колоний к St. аureus отбирают не менее 5 колоний и пересевают на поверхность скошенной питательной среды (мясо-пептонного агара). Посевы инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч. У выросших микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму, плазмокоагулирующую активность, ферментацию маннита в анаэробных условиях. Для определения S.аureus в 1 г (см³) продукта подсчет числа характерных колоний подлежит корректировке, в зависимости от результатов подтверждения принадлежности этих колоний к S.аureus. При подтверждении характерных колоний в 80 % случаев, т. е. не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост S.аureus, то считают, что все характерные колонии принадлежат к S.аureus. В остальных случаях количество S.аureus определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения. Пересчитывют количество S. аureus на 1 г (см³) продукта.

Биологические исследования.

Биологические исследования производят: для изучения способности выделенных стафилококков образовывать энтеротоксин на питательных средах; для выявления наличия стафилококкового энтеротоксина в продукте. В качестве экспериментальных животных могут быть использованы котята (1,5-2-месячные) и взрослые кошки.

Биопроба на котятах. Исследуемый продукт или пятисуточную молочную культуру выделенного стафилококка (15- 20 мл) скармливают котятам натощак. Если котята не едят данный продукт, следует приготовить взвесь продукта в дистиллированной воде (1:1), хорошо гомогенизировать и споить его по 15-20 мл каждому котенку при помощи пипетки или ложки. В опыте должно быть 2-3 котенка. Положительной реакцией считают рвоту, наступившую через 30-60 минут, иногда наблюдается понос и общая прострация. Рвота, появляющаяся через 5-10 минут, неспецифична. Наблюдение за котятами ведут в течение 4-5 часов. Если за этот период котята не реагируют, биологическая проба считается отрицательной.

Биопроба на кошках. Энтеротоксичность определяют путем внутривенного введения материала взрослым кошкам. Этот метод достаточно чувствителен. Недостатком метода является ограниченность его применения для обнаружения энтеротоксина непосредственно в продуктах. Для обнаружения энтеротоксичности культур пользуются 0,75% агаром на бульоне Хоттингера с 0,25% глюкозы рН 7,4. Чашки, засеянные культурами стафилококков, помещают в эксикатор с 20% углекислотой и инкубируют 48 часов при 37⁰С.

Чтобы получить в эксикаторе 20% углекислоты, насыпают на дно двууглекислую соду из расчета 1 г соды на каждый литр объема эксикатора, загружают его чашками и, немного приоткрыв крышку, наливают 10% соляную кислоту непосредственно на соду (на 1 г соды - 8-9 мл кислоты). После добавления кислоты крышку эксикатора быстро закрывают и притирают.

После инкубации чашки вынимают и на поверхность агара наливают 10 мл физиологического раствора, агар измельчают до равномерной кашицеобразной консистенции и оставляют при комнатной температуре на 2 часа. Экстракт центрифугируют до получения прозрачного слоя, который отсасывают, прогревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут и вводят кошкам в количестве 0,5 мл на 1 кг веса тела в вену уха или бедренную вену.

Наличие рвоты и поноса или только рвоты, наступившей в сроки от 30 минут до 3 часов указывает на присутствие энтеротоксина. Каждую кошку можно использовать для этих целей 3-4 раза. При получении отрицательных результатов у кошки, которая ранее была использована для аналогичных определений, необходима проверка на кошке, не бывшей в опыте.

При помощи метода внутривенного введения кошкам решать вопрос о наличии энтеротоксина в пищевом продукте нужно с большой осторожностью. Из продукта, исследуемого на наличие энтеротоксина, готовят взвесь в стерильном физиологическом растворе таким образом, чтобы при последующем центрифугировании получить достаточное количество надосадочной жидкости для постановки биологической пробы. В качестве контроля необходимо получить отрицательный результат у кошки, предназначенной для опыта, при введении надосадочной жидкости, полученной из доброкачественного тождественного продукта, подготовленного тем же способом, что и опытный образец.

 

ГЛАВА 10

ENTEROCOCCUS

Энтерококки - условно-патогенные бактерии рода Enterococcus.

E. faecalis и E. faecium чаще других являются этиологическими факторами пищевых отравлений.

Энтерококки - овальные или сферические бактерии размером 0,6-2,0 х 0,6-2,5 мкм. В мазках из жидких сред располагаются парами или в виде коротких и длинных цепочек, из плотных - в виде диплококков или скоплений кокков, грамположительны. Спор и капсул не образуют. Как правило, не подвижны, иногда подвижны за счет 1-4 жгутиков. Резко полиморфны. Полиморфизм особенно выражен у культур, выделенных из пищевых продуктов. Факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, метаболизм бродильного типа, каталазоотрицательные.

По антигенному строению энтерококки составляют однородную группу, обозначаемую по серологической классификации Лансфилд буквой D. У E.faecalis отмечено наличие видового антигена, который по своей химической природе является термоустойчивым полисахаридом.

Энтерококки довольно медленно растут на обычных питательных средах, для более интенсивного роста в среды добавляют углеводы (глюкозу, лактозу), многоатомный спирт - маннит, дрожжевые препараты (автолизаты. диализаты, экстракты), аминокислоты (агринин, аланин и др.), витамины (рибофлавин, никотиновая кислота и др.). Энтерококки хорошо растут на кровяном и шоколадном агаре.

На плотных питательных средах энтерококки образуют мелкие круглые колонии. При росте в жидких средах они вызывают их диффузное помутнение и образование аморфного осадка.

Критерии Шермена - признаки четко дефференцирующие энтерококки от стрептококков. Они растут при температуре от 10⁰С до 50⁰С (оптимальная температура 37⁰С), при рН 9,6, концентрации NaCl 6,5 % и желчи - 40 %, растут в молоке с 0,1% метиленового синего (обесцвечивание).

Основные виды энтерококков вызывающих пищевые отравления, отличаются по ряду признаков, согласно приложению 29 к настоящей Инструкции.

Свежевыделенные из любого источника штаммы энтерококков, обладающие протеолитическими свойствами, проявляют свои энтеропатогенные свойства, если попадают в организм людей в количествах, составляющих 10⁶ и более живых клеток в 1 г (см³) продукта.

Энтерококки являются облигатными представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и теплокровных животных (у здоровых людей количество энтерококка в 1 г испражнений колеблется в пределах 10⁴-10⁹) в связи, с чем они широко распространены во внешней среде, в различных пищевых продуктах, но особенно часто их обнаруживают в молочных продуктах. Органолептика продуктов зависит от вида энтерококка, обсеменяющего продукт. Так, штаммы E.faecium не изменяют органолептику мясных продуктов, а молоко свертывают и придают ему приятный вкус кисломолочного продукта. Штаммы энтерококков, которые могут вызывать пищевые отравления, придают продуктам неприятный горький вкус и ослизнение, но органолептические изменения в продуктах наступают, когда в них содержится более чем 10⁶ клеток энтерококков в 1 г (см³). Протеолитические вариатны E.faecalis могут вызывать пищевые отравления, симптомами которых являются жидкий стул до 3-5 раз в сутки, боли в животе при нормальной температуре тела.

При лабораторной диагностике энтерококковых пищевых отравлений исследованию следует подвергать продукты, заподозренные как факторы передачи, испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка.

Критерии диагностики. Диагноз энтерококкового пищевого отравления подтверждается, если в продукте и кале больных были обнаружены протеолитические штаммы энтерококков в количествах более чем 10⁶ в 1 г (см³) продукта и более чем 10⁴ в грамме кала при наличии клинических симптомов заболевания.

Бактериологические исследования клинического материала.

Первый день. Рвотные массы и промывные воды желудка перед посевом нейтрализуют 10% раствором двууглекислого натрия до рН 7,2-7,4. Испражнения суспендируют в ИХН 1:10, затем готовят десятикратные разведения до 10^-5 на 0,1% пептонной воде. Из каждого разведения берут по 0,1 мл и высевают на энтерококковую дифференциально-диагностическую среду (далее - ЭДДС). Высеянный материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды. Посевы инкубируют при 37⁰C в течение 24-48 часов.

Второй день. Через 18-24 часа посевы просматривают, обращают внимание на количественную обсемененность и видовую принадлежность выделенных энтерококков. На среде ЭДДС все энтерококки растут хорошо, гемолитически активные штаммы образуют вокруг колоний белые зоны, соответствующие цвету молочного агара, или зоны позеленения среды, у протеолитически активных штаммов появляются четко выраженные темно-красные или бурые зоны вокруг колоний, при наличии обоих (гемолитического и протеолитического) фермента среда вокруг колоний просветляется, приобретая вид обычного питательного агара, штаммы энтерококков не продуцирующих этих ферментов цвет не изменяют. Учитывают способность исследуемых культур к редукции 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлорида (ТТХ). E. faecalis растут в виде вишнево-красных колоний с белыми ободками, колонии E. faecium бесцветны, или окрашены в слабо-розовый цвет. Подвижные формы энтерококков, обладая слабой редуцирующей активностью, образуют карликовые колонии розовых оттенков разной интенсивности. 3-5 колоний отсевают на скошенный агар для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре посевы культивируют при 37⁰C в течение 24 часов.

Третий день. Из роста на скошенном агаре готовят мазки и красят их по Граму. Определяют каталазную активность штаммов. Грамположительные, каталазоотрицательные диплококки подвергают дальнейшему изучению.

Культуры высевают на желчно-щелочной агар (далееЖЩА), сахарно-дрожжевой агар с теллуритом калия, в столбик 0,2 % агара. Окончательно учитывают протеолитическую активность.

Подсчитывают все типичные колонии и число их пересчитывают на 1 г/мл исследуемого материала.

Четвертый день. Учитывают результаты третьего дня. Рост культуры на ЖЩА подтверждает ее принадлежность к энтерококкам. На сахарно-дрожжевом агаре с теллуритом калия растут только штаммы вида E. faecalis, устойчивые к высоким концентрациям теллурита калия. В процессе роста они восстанавливают теллурит калия, образуя при этом черные колонии, окруженные узким бесцветным ободком. В полужидком (0,2 %) агаре, засеянным уколом, подвижные формы энтерококков вызывают диффузное помутнение всего столбика среды, неподвижные виды растут только по ходу укола.

Пищевые продукты. Для определения количества энтерококков, 0,1 или 0,2 см³ продукта или его разведения, высевают на поверхность питательной среды (ЭДДС, канамицин-эскулин-азидный агар и др.). Посевы инкубируют при 37⁰C через 24 ч проводят предварительный, через 48 ч окончательный учет результатов. На канамицин-эскулин-азидном агаре колонии энтерококков оливково-зеленые, до темно-коричнево-черных, с равномерной окраской поля. Учитывают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний.

3-5 колоний отсевают на скошенный агар для дальнейшей идентификации, посевы культивируют при 37⁰C в течение 24 часов.

Из роста на скошенном агаре готовят мазки и красят их по Граму. Определяют каталазную активность штаммов. Дальнейшую идентификацию проводят, как описано выше. Если при подтверждении характерных колоний в 80 % случаев, т.е. не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост энтерококков, то считают, что все колонии принадлежат к энтерококкам. В остальных случаях количество энтерококков определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству колоний, взятых для подтверждения. Результаты пересчитывают на 1 г (см³) продукта.

ГЛАВА 11

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Clоstridium botulinum- вид бактерий рода Clostridium, вызывает ботулизм- тяжелое пищевое бактериальное отравление с преимущественным поражением центральной нервной системы и высокой летальностью. Проявления заболевания зависят от количества токсина, поступившего в организм и состояния больного. Временной интервал между попаданием токсина в организм и появления первых признаков ботулизма, обычно не превышает 24 ч, но может варьировать от 4-6 до 96 часов и более. Ботулизм связан, главным образом, с продуктами домашнего приготовления, заготовленными впрок. Общепринятые в домашних условиях способы обработки пищевых продуктов, такие как консервирование в банках, копчение, маринование, соление и др., не приводят к уничтожению возбудителей ботулизма и их спор и при длительном хранении в этих продуктах может образоваться токсин.

Возбудители ботулизма широко распространены в природе, нормальные обитатели кишечника животных и человека, попадают в почву с фекалиями. Естественный резервуар-почва. Широкое распространение возбудителей ботулизма в почве ведет к попаданию этих микробов на овощи и фрукты, а также к обсеменению сырья, идущего для приготовления консервов, колбас и других продуктов.

Серологическая идентификация C.botulinum основана на выявлении экзотоксинов. В зависимости от антигенных свойств которых разделяют на 7 сероваров: А, В, С, D, E, F, G. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна: для бактерий типов А, В, С, D - 35°С, для типов Е и F - 28- 30°С. Патогенность C. botulinum для разных теплокровных различна. Заболевания у человека вызыввют бактерии типов А, В, Е, F; бактерии типов С, D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана. Главные факторы патогенности C.botulinum – экзотоксины, оказывают нейротоксическое действие на организм, в организме возбудитель практически не размножается. Ботулинические токсины довольно устойчивы к температурным воздействиям. Токсин иногда разрушается только при кипячении в течение 10-15 минут и не разрушается в желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Ботулинический токсин – самый сильный из всех биологических ядов.

C.botulinum типов А, В, С, D, E, F - очень близки по морфологии, культуральным свойствам и по действию их токсинов на организм человека и животных. Все они дают одинаковую клиническую картину болезни. Различные типы ботулинического микроба отличаются по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов, токсин каждого типа нейтрализуется сывороткой того же типа.

По морфологии возбудители ботулизма представляют собой небольшие палочки 0,6-1,0 х 3,0-9,0 мкм с закругленными концами. Палочки образуют субтерминальные или терминальные споры, палочки со спорой имеют вид теннисной ракетки, легко окрашиваются различными анилиновыми красками, молодые клетки грамположительны, при старении культуры (через 4-5 суток роста) палочки окрашиваются грамотрицательно, микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков, капсул не образуют.

Возбудители ботулизма - строгие анаэробы, они растут без доступа воздуха, поэтому обычно размножаются и образуют токсин внутри больших кусков рыбы, ветчины, колбасы, либо в герметически закрытых банках консервов. Возбудители ботулизма типа Е, а также непротеолитические штаммы типа В и некоторые штаммы типа F образуют на питательных средах и в пищевых продуктах кроме токсина и нетоксичный предшественник токсина - протоксин, который, не убивая мышей при парентеральном введении, проявляет свою биологическую активность при попадании в желудочно-кишечный тракт человека и животных в результате воздействия на него протеолитических ферментов.

При добавлении протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) in vitro также происходит активация протоксина, который переходит в токсин. Этот феномен следует учитывать при проведении лабораторной диагностики ботулизма.

Нередко консервные банки, куда вместе с продуктами попадает и возбудитель ботулизма, оказываются бомбажными за счет образования микробом газа, однако, часто при нали­чии микробов ботулизма и ботулинических токсинов пищевые продукты выглядят совершенно доброкачественными и консервные банки не дают «бомбажа». Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла.

Критерии диагностики. Лабораторная диагностика ботулизма преследует цель обнаружения и идентификации ботулинического токсина и выделение возбудителя. Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы) и секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл, промывные воды желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде. Кровь исследуют только на наличие токсина (для чего проводят биологическую пробу), испражнения только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал на наличие возбудителя и его токсина.

Бактериологические исследования.

Обнаружение и идентификация токсина.

Первый день. Пробы исследуют одновременно по двум направлениям: производят обнаружение ботулинических токсинов и ботулинических микробов. Две трети, предварительно подготовленной пробы используют для обнаружения ботулинических токсинов, одну треть - для посевов с целью обнаружения ботулинических микробов.

Часть пробы, которую исследуют на наличие токсинов, выдерживают в течение 1-1,5 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 2500-3000 об/мин, в течение 15-20 минут.

Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или надосадочной жидкостью ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксической сывороткой и реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с диагностикумом эритроцитарным ботулиническим поливалентным типов АВЕ иммуноглобулиновым сухим и диагностикумом эритроцитарным ботулиническим моноспецифическим А, В, и Е иммуноглобулиновым сухим.

Обнаружение ботулинических токсинов в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсинов следует взять для каждой пробы 4-х мышей весом 16-18 грамм. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один или несколько типов ботулинических токсинов, предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулиничеоких диагностических сывороток типа А, В, С, Е, F. С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах: для типа А - 200-400 ME; для типа В - 100-200 ME; для типа С - 200-300 ME; для типа Е - 200-400 ME; для типа F - 50-100 ME.

Доза сыворотки, которую рекомендуют для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе, ибо в организме и выделениях больных, а также в экстрактах из пищевых продуктов, очень сильные токсины почти не встречаются.

Нельзя пользоваться для целей диагностики лечебными противоботулиническими сыворотками.

Для постановки реакции нейтрализации готовят смесь из равных объемов моновалентных сывороток типов А, В, С, Е, F. Типовой протокол развернутой реакции нейтрализации согласно приложению 26 к настоящей Инструкции. Из каждой исследуемой пробы наливают в две пробирки равное количество (1,5-2,4 мл) фильтрата или надосадочной жидкости. Остаток сохраняют в холодильнике для дальнейших исследований. В одну пробирку (контроль) добавляют 0,6 мл физиологического раствора, в другую (опыт)- 0,6 мл смеси моновалентных сывороток.

Содержимое пробирок перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут, после чего содержимое каждой пробирки вводят в объеме 0,7-1,0 мл двум белым мышам. Исследуемый материал из каждой пробирки следует вводить разными шприцами или сначала контроль, а затем опыт.

Наблюдение за животными проводят в течение 4-х дней, однако, если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставят реакцию нейтрализации с моновалент­ными сыворотками. Ботулинический токсин не дает молниеносной гибели животных (в течение нескольких минут или секунд), мыши погибают не ранее, чем через 4-5 часов.

При наличии ботулинического токсина погибают две мы­ши контрольные, которым вводили несмешанный с сыворотками фильтрат, опытные мыши остаются живы.