ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ 5 страница

Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.

В случае гибели всех 4-х мышей, т. е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).

Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250-300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток А, В, С, Е, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или надосадочной жидкости), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.

В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.

В 6 пробирок разливают по 2,4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа А, во вторую - типа В, в третью - типа С, в четвертую - типа Е, в пятую - типа F, в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Все сыворотки наливают разными пипетками. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки отдельными шприцами, типовой протокол развернутой реакции нейтрализации согласно приложению 30 к настоящей Инструкции.

Учет результатов проводится через 4-6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4-х дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки № 1, то в исследуемом мате­риале будет установлен токсин типа А.

Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как ее обычно бывает мало. Следует сразу поставить развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками только типов А, В, Е, т.к. остальные типы ботулинических палочек встречаются очень редко. Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа А - 0,4 мл, во вторую - типа В, в третью - типа Е. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного, контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.

При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками дают заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывают его тип.

Нередко постановку реакции нейтрализации, как с поливалентной, так и с моновалентной сыворотками приходится повторять из-за неспецифической токсичности посторонней микрофлоры, которая обычно имеется в рвотных массах, кале, органах трупов, поэтому в лучшем случае ответ о наличии токсина в пробе может быть дан на 2-3 день, а о его типовой принадлежности на 3-5 день от начала исследования.

В настоящее время установлено, что противоботулиническая сыворотка типа Е нейтрализует также ботулинический токсин типа F и наоборот. Поэтому при получении положительной реакции нейтрализации одновременно с противоботулиническими сыворотками типа Е и F следует провести дифференциальную диагностику: необходимо определить, относится ли обнаруженный токсин к типу Е или к типу F. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа Е и типа F, разведенными до концентрации 1 МЕ/мл. Удобнее всего для этих целей использовать стандартные противоботулинические сыворотки, выпускаемые ГКИ им. Тарасевича. Для этого в три про­бирки наливают по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку наливают 0,6 мл диагностической сыворотки типа Е, во вторую- 0,6 мл типа F, разведенных до концентрации I ME/мл, в третью - контрольную - 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа Е, то в экстракте имеется токсин типа F. Если наряду с контролем погибают мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой типа Е, то в экстракте токсин типа Е.

Обнаружение ботулинических токсинов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция пассивной гемагглютинации (микрометодом) позволяет получить ответ о содержании ботулинических токсинов в воде, воздухе, смывах, продуктах питания, фураже, силосе и.т.д через 3-4 часа. При этом используются диагностикумы эритроцитарные ботулинические моноспецифические типов А, В и Е и поливалентные типов АВЕ иммуноглобулиновые сухие. Эритроцитарные диагностикумы (ЭД) представляют собой лиофилизированные в объеме 1 мл 3 % взвеси эритроцитов барана, сенсибилизированные антителами (иммуноглобулины класса G) к ботулиническим токсинам типов А, В или Е. Постановка РПГА согласно инструкции по применению.

Обнаружение возбудителей ботулизма.

Первый день. Для обнаружения возбудителей ботулизма производят посев 3-5 мл из 1/3 предварительно подготовленного материала на жидкие питательные среды. Для первичных посевов используют печеночно-глицериновую среду, бульон триптиказо-пептонно-глюкозный с дрожжевым экстрактом и трипсином, бульон Хоттингера, среду Китт-Тароцци, среду питательную для контроля стерильности и др. Необходимо, чтобы рН был в пределах 7,2-7,4. Обязательным является наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиновых - отварного пшена и ваты. Пробирка или флакон должны быть заполнены питательной средой не менее чем наполовину. Перед посевом среды нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 минут, после чего быстро охлаждают, добавляют 0,5% глюко­зы и производят посев.

Посевы необходимо производить в среды в больших пробирках или во флаконах емкостью по 100-200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной в 0,5 см. Лучше засевать исходный посевной материал в большой объем среды (70,0-150 мл), чтобы культуральной жидкости первичного посева хватило на все исследования (постановка реакции с поливалентной сывороткой и развернутой реакции нейтрализации, нередко с двух или трехкратным повторением). Последующие пересевы исследуемых проб из первичного посева в те же жидкие питательные среды могут не дать токсинообразования в среде, из-за бурного роста посторонней микрофлоры.

Посев производить в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60⁰С 15 минут. В этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры C.botulinum типа Е, которые погибают при 80⁰С; другой флакон прогревают при 80⁰С 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60⁰С, инкубируют при 28⁰С, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80°, инкубируют при 35⁰С. Первые два флакона исследуют на C.botulinum, типов Е и F, вторые два флакона на C.botulinum типов А, В, С.

Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образом, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева. Рост C.botulinum, характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша.

После посева все исходные образцы проб следует хранить на холоду до окончания исследования. Через 48 часов после появления роста посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.

Есть сообщение зарубежных ученых о том, что для выявления C.botulinum типа Е в среду перед посевом следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1%. В опытах этих исследователей процент выявления C.botulinum типа Е из почвы увеличился на среде с трипсином до 74% исследуемых проб, в то время как исследование этих проб на среде без трипсина дало положи­тельный результат лишь в 17% проб.

Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15-20 мл. Трипсин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через асбестовые стерилизующие пластины фильтра Зейтца и добавить из расчета 1 мл 1%-го раствора трипсина на 10 мл среды во флаконы, которые будут инкубироваться при 28⁰С. В тот флакон, который предварительно прогревается, трипсин добавить после прогревания.

Второй день. Через 48 часов от начала роста из всех флаконов с соблюдением стерильности берут пробы культуральной жидкости (по 10-15 мл) и подвергают их исследованию. Предварительно готовят мазки, красят их по Граму и микроскопируют.

С культуральной жидкостью ставят реакцию нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов А, В, С, Е, F, как это описано для определения токсинов. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно.

При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типич­ных по морфологии для C.botulinum, а также ботулинического токсина дают заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма и наличии в нем ботулотоксина. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.

Если в посевах обнаруживают микробы, по морфологии сходные с C.botulinum, а токсин отсутствует, то следует перед постановкой реакции нейтрализации провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином для обнаружения ботулинических токсинов типа Е, непротеолитичных штаммов типа В и некоторых штаммов типа F, а также провести выделение и изучение чистых культур. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулиническими сыворотками проводят только в том случае, если в среду перед посевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.

Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжить инкубацию посевов в термостате, а исследование провести вновь на 4-6-10 сутки. Если исследования, проведенные на 10 сутки, не дали положительных результатов по обнаружению возбудителей ботулизма и их токсинов, то выдают ответ об отсутствии ботулинических палочек и их токсинов в исследуемых материалах.

Посев в высокий столбик агара.

Для выделения чистых культур ботулинических палочек применяют 1-1,5% агар с глюкозой, приготовленный на бульоне Мартена или бульоне Хоттингера, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15-18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45-50⁰С. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал (чаще это первичный посев материала исследуемого) и переносят последовательно из пробирки в пробирку, тщательно перемешивая, после чего агар перемешивается еще раз путем перекатывания пробирок между двумя ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35-37⁰С. На каждый посев следует брать 5-8 пробирок столбика агара. Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5-10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80⁰С 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.

Через 1-2 суток в последних пробирках появляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии пересевают на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшуюся часть колонии микроскопируют.

Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами: столбик агара прокалывают сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекают нужную колонию; дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревают на пламени горелки; под действием паров закипевшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри. Подозрительную колонию извлекают отломанным капилляром пастеровской пипетки.

Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.

Посев на чашки.

Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного или печеночного агара, разлитого толстым слоем (приблизительно 3-5 мм) в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель еще на 2-3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат крышкой кверху и выращивают при температуре 35-37⁰С.

С целью поддержания достаточного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1-0,2 см, окруженные зоной гемолиза. Ввиду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении C.botulinum особенно типа Е из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов, рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на устойчивости спор палочки ботулизма к 50% спирту.

К 2 мл культуральной жидкости 2-3-дневной инкубации при 28⁰С, содержащей ботулинический токсин типа Е, добавляют равный объем этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из нее делают высев на 2-3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлажденного до 50⁰С агара). Через 48 часов инкубации при 35⁰С в анаэростате, среди колоний посторонней микрофлоры, C.botulinum дают небольших размеров колонии, окруженные «жемчужным поясом». Следует отметить, что некоторые спорогенные анаэробы (C.sporogenes и др.) также имеют вокруг колоний «жемчужный пояс». Эти колонии высевают в пробирки со средой Китт-Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры C.botulinum типа Е.

При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливается в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, почти застывший, помещается вторая половина чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади, и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов.

Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.

С поверхности чашки колонии снимают петлей или пастеровской пипеткой и засевают в пробирки со средой Китт-Тароцци с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяют на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем постановки реакции нейтрализации на мышах.

Метод активации прототоксина C.botulinum.

Активацию прототоксинов производят в экстрактах из пищевых продуктов, промывных вод желудка и рвотных масс, а также культуральной жидкости посевов, если исследуемый материал был засеян в среду без трипсина или панкреатина.

Чистый сухой трипсин растворяют перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1:100 (1%-й раствор); этот раствор принимают за исходный. Для активации берут данный раствор из расчета, чтобы в активируемой культуральной жидкости его концентрация была равна 0,1%.

Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовят следующим образом: 4 г панкреатина растворяют в 100 мл ИХН и оставляют в холодильнике при 4⁰С на 12 ч. Перед употреблением полученную жидкость фильтруют через плотный бумажный фильтр, а затем через стирилизующую пластинку фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Готовый раствор панкреатина может сохраняться при 4⁰С в течение двух недель.

Исследуемую 4-5-суточную культуру, полученную на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергают центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.

Готовый раствор трипсина добавляют из расчета получения в культуральной жидкости концентрации 0,1%, для чего на 1 мл культуральной жидкости берут 0,1 мл исходного 1 % раствора трипсина.

Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральную жидкость смешивают в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина.

Полученные смеси помещают в термостат при 37⁰С на один час. По истечении указанного срока в активированной жидкости определяют наличие ботулотоксина на белых мышах путем постановки реакции нейтрализации.

Для обнаружения ботулинических токсинов рекомендован ряд других методов, каждый из которых может быть только ориентировочным и должен всегда подтверждаться реакцией нейтрализации на мышах. Это - реакция непрямой гемагглютинации или бентонитовой флокуляции, реакция подавления фагоцитоза, реакция двойной диффузии в геле, люминесцентно-серологический метод для обнаружения возбудителей ботулизма.

Однако, как правило, все перечисленные методы дают положительный результат в руках авторов и только с чистыми штаммами и их токсинами. Эти методы недостаточно специфичны ввиду наличия общих самотических и нетоксичных растворимых антигенов у возбудителей ботулизма и микроорганизмов группы C.sporogenes и C.putrificum. Кроме того, эти реакции не выявляют степени токсичности фильтрата. В силу вышесказанного ни один из указанных методов не применяется, как общепринятый, ни в одной стране. Только биологическая проба на белых мышах в реакции нейтрализации с типоспецифическими противоботулиническими сыворотками является общепринятым методом, метод принят международной ассоциацией микробиологов.

 

ГЛАВА 12

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

C.perfringens – вид бактерий рода Clostridium - один из наиболее распространенных патогенных видов. По способности образовывать четыре главных токсина (α-, β-, ε-, τ-) микроорганизмы разделяют на шесть сероваров: А, В, С, D, E и F. C.perfringens распространены повсеместно; бактерии выделяют из воды почвы, сточных вод. Они колонизируют кишечник животных и человека (выделяют у 25-35% здоровых лиц). Других природных резервуаров помимо пищеварительного тракта C. perfringens не имеют, почва и другие объекты внешней среды обсеменяютс ими только фекальным путем. У человека C.perfringens вызывает два типа поражений - газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции.

Вегетативные клетки C.рerfringens представлены короткими крупными палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0х1х1,5 мкм). Отличительные особенности бактерий - строго положительная окраска по Граму и отсутствие подвижности. In vivo образуют капсулу. Бактерии хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в старых культурах могут быть грамотрицательными. Споры крупные овальные расположены центрально или субтерминально. Термоустойчивость спор сероваров В и D относительно невысока, погибают при кипячении в течение 15-30 мин, споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении в течение 1-6 часов. C.рerfringens типа А относительно толерантна к кратковременным кислородным воздействиям и способна расти в высоких столбиках сред, без герметизации вазелиновым маслом. На плотных средах бактерии образуют S-и R- колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями. Сначала они прозрачные, позднее становятся мутными серовато-белыми, R- колонии неправильной формы, бугристые с неровными шероховатыми краями; в глубине агара напоминают комочки ваты. На агаре с кровью обычно окружены зоной гемолиза. Характерное свойство колоний C.perfringens типа А, служащие дифференцирующим признаком, - способность менять серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в анаэробных условиях. На желточном агаре бактерии образуют колонии, окруженные зоной перламутрового преципитата, образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы. Культуры C.рerfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. На средах содержащих глюкозу рост происходит очень бурно, с образованием Н₂ и СО₂ и заканчивается через 8-12 часов. Первые признаки роста на среде Китт-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 часа (особенно при 43⁰С) и проявляются помутнением и появлением пузырьков газа. Бактерии ферментируют углеводы с образование кислоты и газа, От прочих C.рerfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая: расжижает желатину, не разлагает казеин, интенсивно створаживает молоко. C.рerfringens образует 12 токсинов (ферментов) и энтеротоксинов. Продуцентами энтеротоксина являются бактерии типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции.

C.perfringens, типов В, Д, Е вызывают тяжелые энтеротоксемии у мелкого и крупного скота, а также у птиц, можно предполагать их этиологическое значение при пищевых отравлениях у людей, в случае употребления в пищу мяса животных, обсемененных штаммами этих типов.

C.рerfringens типа А вызывает токсикоинфекции легкой и средней степени тяжести. Заболевание развивается остро, с болями в животе, рвотой и диареей (до 20 раз в сутки). Симптомы исчезают в последующие 12-24 ч, летальные исходы наблюдаются редко. Установлено, что при пищевых токсикоинфекциях, вызываемых C.perfringens типа А, основную роль в патогенезе заболевания играет энтеротоксин, вырабатываемый in vivo спорулирующими клетками этих микроорганизмов, которые попадают в желудочно-кишечный тракт при интенсивном обсеменении пищевых продуктов (10⁵ и более в г/см³) указанными бактериями.

C.рerfringens типа С вызывает некротический энтерит. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента, в течение 18-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серовара А. Пищевые отравления чаще имеют место после употребления готовых мясных блюд, а также продуктов растительного происхождения, которые оказываются значительно обсемененными клетками C.perfringens типа А в результате нарушения правил приготовления и хранения пищи.

Критерии диагностики. При наличии клинических симптомов заболевания результаты бактериологического исследования подтверждают диагноз пищевого отравления, если получены следующие данные анализа: высокая обсемененность C.perfringens (более 10⁵ в г/см³) пищевых продуктов или 10⁶ в 1 г фекалий.

Бактериологические исследования.

Первый день. В пищевых продуктах и материале от больного (исключая кровь) определяют: наличие бактерий C.perfringens и массивность обсеменения этими микроорганизмами, наличие токсигенных штаммов C.perfringens типов А, В, С, D, Е.

В крови больного с явлениями анаэробного сепсиса и материалах от трупа определяют наличие C.perfringens типов А, В, С, D, Е и их специфических токсинов.

Из подготовленных к исследованию материалов (пищевые продукты, рвотные массы, испражнения и др.) готовят разведения на 0,1% пептонной воде до 10^-10.

По 1 мл материала из соответствующих разведений переносят в расплавленную и охлажденную до 45⁰С среду Вильсон - Блер, разлитую по 8-9 мл в пробирки. Можно так же использовать кровяной или желточный агары в чашках. Для этого 1 мл каждого разведения добавляют в 15 мл охлажденного до 45⁰С агара, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри. После застывания смеси заливают дополнительно стерильным, охлажденным до 45⁰С 2% мясо-пептонным агаром, слоем не менее 2 мм. Инкубируют 6-8 часов в термостате при 45-46⁰С или 20 часов при 37⁰С.

Кроме того, гомогенаты исследуемых материалов засевают в объеме 10-15 мл на любую из жидких сред (Китт-Тароцци и др) разлитых по 70 мл во флаконы.

Каждый образец материала (исключая кровь) вносят в 2 флакона среды, один флакон с посевом прогревают при 80⁰С 20 минут, а другой - не прогревают, затем оба флакона инкубируют при 37⁰С. В условиях прогревания обычно погибает посторонняя микрофлора и часть анаэробов, находящихся в вегетативной форме. Сохраняются споры C.perfringens, которые в этих условиях активно прорастают. В выросших культурах из прогретых посевов в ряде случаев, может находится только C.perfringens, т.е. чистая культура этих бактерий. Кровь, в случае бактериемии, взятая стерильно, будет содержать только вегетативные клетки C.perfringens. Поэтому посев крови производится без прогревания.

Интенсивное газообразование, которое свидетельствует об активном росте культуры, может наблюдаться через 3-6 часов после посева материала, доставленного не позже суток. В этом случае следует проводить бактериологические исследования в первый день. При отсутствии активного роста через 6-8 часов, посевы инкубируют при 37⁰С в течение 18-20 часов.

Второй день. В посевах на среде Вильсон-Блер производят подсчет черных колоний, где имеется от 10 до 30 колоний, или на чашках, где содержится от 20 до 100 колоний с зоной гемолиза, или с зоной опалесценции. Умножают количество колоний на разведение материала в этой пробирке, или чашке Петри. Так, если в 6 пробирке или чашке содержится 30 характерных колоний, обсемененность 1 г (см³) или 1 мл исходного материала будет составлять 30х10⁶. Делают мазки из 3-5 характерных колоний, окрашивают краской для анаэробов или по Граму. Кроме того, 2-4 колонии пересевают на лакмусовое молоко и 3-5 колоний на любые из мясных сред в пробирках для получения чистой культуры.

Определение токсинов следует проводить через 3-6 часов после посева материала на жидкие среды при появлении признаков начала роста культуры (см. первый день исследования), или на вторые сутки, если посевной материал вырастает только через 18-20 часов инкубирования. Из культур на жидких средах, где отмечен рост с газообразованием, готовят мазки, окрашивают по Граму или краской для анаэробов. Те посевы, в которых обнаруживают грамположительные палочки, похожие по морфологии на C.perfringens, проверяют на присутствие специфических токсинов C.perfringens типов А, В, С, D, Е методом реакции нейтрализации с диагностическими сыворотками C.perfringens типов А, В, D, Е на белых мышах весом 16-18 г.

Сухие противоперфрингенс сыворотки перед употреблением разводят дистиллированной водой. В каждую ампулу с сухой сывороткой добавляют по 1 мл воды, при легком встряхивании сыворотка полностью растворяется. Затем сыворотки А, В, D, Е разводят в 10 раз ИХН и в разведенном виде применяют для постановки реакции нейтрализации.

Постановка реакции нейтрализации. Из флаконов в стерильных условиях отбирают по 8-10 мл культуральной жидкости. Оставшуюся культуру во флаконах хранят при температуре 4-10⁰С до окончания исследования. После центрифугирования три 3000-5000 об/мин в течение 30 мин в надосадочной жидкости должны находиться токсины C. perfringens.

Первоначально ставят реакцию нейтрализации токсина в исследуемой жидкости с сывороткой C.perfringens типа А. Для этого в 2 пробирки вносят по 1,5 мл надосадочной жидкости. Затем в 1 пробирку добавляют 0,75 мл антитоксической сыворотки типа А, во 2-ю контрольную - 0,75 мл физиологического раствора. Смесь выдерживают 30 минут при 37⁰С, затем вводят по 0,75 мл в хвостовую вену 2-ум белым мышам весом 16-18 г. Сначала вводят смесь из контрольной пробирки, затем тем же шприцом - смесь из опытной пробирки. Реакцию учитывают через сутки.

Третий день. Просматривают пробирки с посевами на лакмусовом молоке. Появление характерного сбраживания с просветлением сыворотки и образованием сгустка кирпичного цвета является дополнительным подтверждением того, что колонии черного цвета, а также колонии с зонами гемолиза и преципитата на плотных средах, определяющие обсемененность исследуемого материала, относятся к C.perfringens. Учитывают реакцию нейтрализации. Если контрольные мыши пали, а получившие смесь токсина с сывороткой типа А - живы, следует дать заключение, что в исследуемом материле обнаружен C. perfringens типа А, активностью не менее 3 Дlm/мл (для белой мыши) и закончить исследование.