Байстэндер эффект

До последнего времени считалось, что генегические последствия, вызванные воздействием облучения, связаны с эффектом прямого повреждения ДНК. Классическая догма радиобиологии, интерпретированная из теории мишени, постулирует, что генетические повреждения происходят только в процессе либо немедленно сразу после передачи энергии ионизирующих частиц ядерной ДНК (мишенные эффекты) и является следствием только прямого эффекта радиации либо воздействия короткоживущих радиационно-индуцированных радикалов кислорода; при этом биологические последствия наблюдаются в течение одного или двух клеточных поколений

Многочисленные данные, которые появились в последние годы, свидетельствуют о том, что ионизирующее излучение может вызывать биологические эффекты (включая повреждение ДНК), не пересекая ядро – то есть внемишенные эффекты. В ряде исследований было показано, что генетические изменения могут происходить в большем количестве клеток, чем ожидалось при облучении культуры клеток млекопитающих слабым потоком α-частиц, при котором только через очень малую часть клеток непосредственно проходили частицы. Эти и другие исследования (перенос облученной среды от клеток-доноров необлученным реципиентам, инкорпорирование радионуклидов и облучение с использованием пучка заряженных частиц показали, что облучение клеточного ядра не является необходимым условием для формирования генетических повреждений либо биологического ответа. Необлученные клетки, находящиеся в окружении облученных клеток либо реципиенты питательной среды от облученных клеток также могут отвечать на радиационное воздействие (рис.1).

Рисунок 1 Схема индукции байстзндер эффекта

 

Таким образом, основной чертой «внемишенных» эффектов радиации является то, что прямое облучение ядра (ДНК) не является необходимым для их проявления. Одним из таких внемишенных эффектов является «байстэндер эффект» (bystander effect) - это явление передачи информации, вызывающей клеточные повреждения, от клеток, пораженных каким-либо агентом, другим клеткам, на которые прямо этим агентом не воздействовали. Соответственно, радиоиндуцированный байстэндер эффект – это явление передачи информации, вызывающей клеточные повреждения, от облучённых клеток необлучённым.

К настоящему времени накоплено огромное количество экспериментальных данных, полученных на различных модельных системах, доказывающих наличие байстэндер эффекта.

 

1.2. Байстэндер эффект при облучении

В 1954 г. Парсонс показал, что у детей, которым облучали селезенку для лечения лейкемии, наблюдалось поражение костного мозга. Это является первым свидетельством того, что радиационное поражение не ограничивается облученными клетками.

В последние годы в лабораториях всех развитых стран продемонстрироно существование вызываемого облучением байстэндер эффекта, при котором повреждения возникают в необлученных клетках. В этих работах предполагается, что эффективное сечение мишеней потока радиоактивных частиц намного больше, чем размер ядра. В ранних работах Нагасава и Литтл по данной теме клетки культур Chinese hamster облучались альфа-частицами в дозах между 0.03 и 0.25 cGy, так, чтобы только около 1% клеток были подвержены прямому действию облучения. Однако хромосомные повреждения наблюдались более чем у 30% популяции. Таким образом, их данные показали, что повреждение ДНК может быть вызвано в большем количестве клеток, чем в том, которое подверглось облучению (рис.1).

Это было неожиданным и противоречило модели прямого повреждения. В данной статье изменялось представление об устоявшейся классической модели прямого поражения клеток. В течение последующих нескольких лет результаты, полученные в ряде лабораторий, подтвердили данный факт. Концепция байстэндер эффекта получила признание. Клеточные реакции, вызванные с помощью этого эффекта, включают в себя индукцию хромосомных аберраций, генные мутации, инактивацию и гибель клетки, апоптоз (или программируемую клеточную смерть), злокачественную трансформацию и генетическую нестабильность.

Было показано, что облучение 20-тью альфа-частицами приводит к увеличению частоты мутаций в 3 раза больше, чем ожидалось, полагая, что данный эффект не существует (рис 2).

 

 

Рисунок.2Демонстрация байстэндер эффекта при воздействии радиации: одиночная альфа частица проходит через клетку A, передавая ей дозу радиации. Это в свою очередь приводит к повреждениям в клетках B, C, D, хотя доза прямого воздействия для данных клеток равнялось нулю.

 

Множество исследований байстэндер эффекта стали возможными благодаря использованию микролучей, позволяющих малому количеству заряда (легких ионов) попасть в единичное клеточное ядро (рис.2).

Последующие работы показали что,

(а) клетки, облученные прицельным микропучком альфа-частиц, могут индуцировать мутагенный ответ в близлежащих клетках, не подвергшихся прямому облучению,

(б) межклеточное взаимодействие играет основную роль в возникновении данного феномена.

1.3. Байстэндер эффект, вызванный различными видами излучения:

Байстэндер эффект в клетках, вызванный воздействием альфа-частиц:

Было признано, что альфа-частицы, пересекая ядро клетки и повреждая ДНК, вызывают генетические нарушения. Данные повреждения ДНК могут вызвать мутации или хромосомные аберрации в дочерних клетках. Эксперименты, проводимые Нагасавой (Nagasawa) и Литтлом (Little) в 1992 году, показали, что область генетических изменений, вызванных байстэндер эффектом, в 9-350 раз больше, чем область непосредственного поражения. Механизмы данного эффекта, вызванного воздействием облучения альфа-частицами, до сих пор остается неясным. Тем не менее, предполагают, что щелевидные соединения между клетками участвуют в его распространении после действия низких доз облучения альфа-частицами.

Байстэндер эффект, вызванный воздействием бета-частиц:

Байстэндер эффект, вызванный воздействием бета-частиц:

был продемонстрирован в многоклеточной модели с помощью группы клеток, помеченных тритиированным тимидином ([3H]dThd). Малая область распространения бета-частиц ³H вызывает лишь поражение меченых клеток, а немеченые клетки не повергаются воздействию излучения. Однако в результате, немеченые клетки также оказываются пораженными. Щелевидные соединения между клетками вовлекаются в байстэндер эффект, который имеет место до тех пор, пока линдан (γ-изомер гексахлороциклогексана), ингибитор межклеточных процессов, осуществляемых через щелевидные соединения, не проявит защитный эффект.

Байстэндер эффект, вызванный воздействием гамма-частиц:

Mothersill et Seimour разработали способ исследования байстэндер эффекта, индуцированного гамма-дучами.

Для этого использовали облучение клеточных культур эпителиальных клеток человека гамма-дучами. После облучения культуральную среду пропускали через специальные микропористые фильтры для удаления клеток. Отфильтрованную питательную среду переносили к интактным клеткам. Было показано, что культуральная среда от облученных гамма-лучами повреждает необлученные клетки – в клетках наблюдалось снижение жизнеспособности и колонеобразующей активности, а также возрастание частоты микроядер, что свидетельствовало о наличии байстэндер эффекта.

Различные способы исследования байстэндер эффекта изображены на рис 3

Рис.3. Методы изучения байстэндер эффекта

 

1.4. Как сравнить байстэндер эффект и эффект прямого повреждения?

Данные, полученные при изучении байстэндер эффекта, указывают на значительную разницу между байстэндер эффектом и эффектом прямого повреждения. Схематически на рис. 4 приведены для канцерогенных преобразований in vitro вклад эффекта прямого повреждения, байстэндер эффекта и их сумма.

При достаточно высоких дозах эффект прямого повреждения убивает все клетки в облученной популяции

Перевести на русский язык

Рис. 4 Схема удельных вкладов байстэндер эффекта и эффекта прямого повреждения в общее значение радиационного риска.

В этом случае вклад байстэндер эффекта незначителен и степень риска заболевания прямо пропорциональна плотности облучения. С другой стороны, байстэндер эффект наблюдается при облучении малой части клеток и повреждения обнаруживаются среди тех клеток, которые даже не подвергались воздействию. Обычно от 1 до 30 процентов необлученной фракции клеточной популяции могут обнаруживать повреждения вызванные байстэндер эффектом. В этом случае байстэндер эффект преобладает над эффектом прямого повреждения.

При прямом повреждении процент погибающих клеток прямо пропорционален дозе, а при байстэндер эффекте наблюдается низкий порог дозы, за которым клеточный ответ представляет плато – дальнейшее повышение дозы не вызывает увеличения количества поврежденных клеток.

Существуют две основные теории, объясняющие наличие плато. Одна из них - есть уже существующая доля клеток в популяции, которая чувствительна к сигналам об облучении соседних клеток. А вторая – то, что вся популяция клеток отвечает на сигналы, но также одновременно генерирует подавляющий сигнал, который ограничивает ответ определенной фракцией клеток.

Есть две основных области, где байстэндер эффект может играть важную роль. Первая связана с риском облучением низкими дозами естественного радиоактивного фона. Условная оценка облучения показывает, что естественный радиоактивный фон является причиной 3% всех случаев злокачественных опухолей, но является ли это преувеличением либо недооценкой – это частично зависит от предположений о биологическом действии на единичные клетки.

Байстэндер эффект также может иметь значение при некоторых видах лучевой терапии. Например, при лечении рака точечное воздействие радиации не всегда может достигнуть цели, и тогда необлученные клетки опухоли поражаются с помощью его механизмов.

 

1 .5. Исследования байстэндер эффекта in vivo.

Радиационно-индуцированный «байстэндер» эффект не является исключительно явлением in vitro на клеточных культурах. Появляется все больше свидетельств того, что «байстэндер» эффект также может быть обнаружен in vivo.

Brooks и соавт. [1974] показали, что при накоплении α-источников в печени Китайского хомячка все клетки печени обладают одинаковым риском индукции хромосомных повреждений, даже если очень малая часть всей популяции подверглась облучению. В другом исследовании при трансплантации отличающихся цитогенетическими маркерами облученных и необлученных клеток костного мозга в последующих клонах гемопоэтических стволовых клеток наблюдалась хромосомная нестабильность [Watson и соавт., 2000].

В результате облучения нижней части легкого крыс наблюдалась повышенная частота микроядер в необлученной верхней части легких, которая снижалась при предварительном введении супероксид дисмутазы Схожий радиационно-индуцированный «байстэндер» эффект был описан у пациентов с хронической лейкемией и в костном мозге детей с хронической гранулоцитарной лейкемией в результате облучения селезенки

Особое значение «байстэндер» эффект имеет при фракционной терапии. Было показано, что культуральная среда от клеток, облученных несколькими фракциями, обладала более выраженным цитотоксическим эффектом при переносе клеткам-реципиентам по сравнению с средой от клеток, получивших одиночную равную дозу облучения. Этот эффект противоречит наблюдаемому восстановлению при прямом фракционном облучении культуры клеток – адаптивному ответу. Таким образом, образование «байстэндер» факторов in vivo может способствовать снижению «щадящего» эффекта, являющегося целью фракционной радиотерапии.

В настоящее время в некоторых клиниках врачи борются с солидными опухолями путем пространственной фракционной радиотерапии, опосредованной формированием «байстэндер» эффекта, что способствует регрессии опухолей и снижению дозы обучения пациентов Результаты этих и других исследований убедительно свидетельствуют, что «байстэндер» эффект существует не только исключительно в культурах, но и in vivo.

При остром облучении, выделение и эффект «байстэндер» факторов может быть больше и происходить в более короткие сроки. В то же время при хроническом низкодозовом облучении количество выделяемых в кровяное русло факторов может быть в очень малой концентрации, не способной вызвать клеточное повреждение вне зоны локализации источника. Таким образом, на основании этих исследований можно сделать вывод, что «байстэндер» эффект, индуцированный малыми дозами, не будет обладать каким-либо эффектом вне облученной ткани и, следовательно, не будет иметь большое значение in vivo.

Понимание эффектов радиации как скоординированного многоклеточного воздействия, поражающего не только облученные, но и необлученные клетки, позволяет определить вклад эффектов в необлученных клетках в оценку радиационных рисков. В результате при оценке радиационного риска во всех моделях канцерогенеза однозначно должны приниматься во внимание не только мишенные, но и немишенные аспекты радиационного воздействия.

Очевидно, что будущие терапевтические методы будут включать восстановление тканевой способности контролировать ответ на радиационное воздействие.