Получение мутаций- химические мутагены (радиация) - мобильные элементы - инсерции векторных молекул в геном при трансформации (трансгенные технологии) В.В. Сахаров 1932 г – открытие химических мутагенов. 1946 г – открытие супермутагенов (этиленимин) мутагенез позволяет получать широкий спектр изменений у хозяйственно-ценных и декоративных культур Более тонкие методы внесения изменений в гены (мутаций) – генный нокаут - внесение направленных изменений в нуклеотидную последовательностьнужного гена (Марио Капекки, Оливер Смитис, Мартин Эванс). "Генный нокаут" выключение определенного гена путем целенаправленного внесения изменений в его нуклеотидную последовательность. «Генный нокаут» использует рекомбинацию ДНК в стволовых клетках. Метод генного нокаута: 1.Нужно получить измененную (неработающую) форму гена, который изучается 2.Ввести ее вместо нормального (работающего) гена в стволовую клетку 3. Получить клон таких клеток с измененным геном 4.Получить из них многоклеточные организмы 3. Гомеозисные гены Они определяют процессы роста и дифференцировки организма у растений и животных, мутации в них приводят к превращению одних органов в другие. Гомеозисные гены животных содержат участок-гомеобокс- почти одинаковый у всех видов. Их называют Hox («хокс») – гены, т.к. это гомеобокс - содержащие гены. Это древние гены, появившиеся >1000 млн лет назад. Консервативные гомеозисные гены животных размечают разные участки тела в эмбриогенезе разных видов животных. Они расположены на одной или нескольких хромосомах тесными группами (до 45 у млекопитающих). Их функция состоит во «включении» и «выключении» других генов. Линейный порядок генов внутри кластера соответствует времени и месту работы гена в ходе эмбрионального развития. Нох-гены найдены у всех исследованных организмов (в геномах губок, гидры, пиявок, нематод, амфибий, рыб, млекопитающих). Пример 1. Ген Hox c-6 контролирует образование грудного отдела позвоночника. У курицы ген Hoxc-6 отвечает за образование 7 грудных позвонков, образующих ребра. У змеи домен его экспрессии начинается от головы и простирается до клоаки → тело змеи = сплошная грудь. Вывод: Hox-гены действительно детерминируют разные отделы тела эмбриона вдоль переднее-задней оси. НОХ-гены включаются в онтогенезе несколько раз. Они не только размечают участки тела вдоль передне-задней оси, но играют важную роль в развитии многих органов. Пример 2. Гомеозисные мутанты арабидопсис. ABC-модель развития органов цветка АВС –модель – современная парадигма генетики развитии: дифференциация органов цветка определяется работой 3 классов регулирующих генов: гены класса А отвечают за развитие чашелистиков, в сумме с генами класса В они определяют формирование лепестков, совместная работа генов класса В и С ведет к развитию тычинок, а гены С сами по себе контролируют появление пестика в центре цветка. При нарушении работы этих генов одни части цветка превращаются в другие (тычинки в лепестки или лепестки в чашелистики). Фолиарная (классическая) теория морфогенеза цветка Иоганна Вольфганга Гете: Цветок – видоизмененный побег с укороченными междоузлиями. Органы цветка – преобразованные листья. 1790г. «Опыт о метаморфозе растений» 1810г. «Учение о цветке» Фенотип тройного мутанта – убедительное свидетельство в пользу фолиарной теории морфогенеза цветка Гете. Пример 3. гомеозисные мутации найдены и у Дрозофилы антенна - нога (доминантная мутация) - трансформация передних разделов в задние из-за того, что у этого мутанта ген ANTP экспрессируется в голове, а не груди. 4. Внешняя среда и геном Внешняя среда вступает в диалог с геномом уже во время внутриутробного развития. Алкоголь через РК влияет на экспрессию многих генов, которые важны как на ранних этапах эмбриогенеза, так и на стадии гаструляции и органогенеза (например, на развитие конечностей). Эти данные объясняют, почему употребление алкоголя во время беременности ведет к выраженным аномалиям у новорожденных, которые получили название эмбрионального алкогольного синдрома. Алкоголь через РК влияет на экспрессию многих НОХ-генов, которые важны не только на самых ранних этапах эмбриогенеза, но и на стадии гаструляции и органогенеза Изменения экспрессии регуляторных генов, контролирующих развитие, приводят к нарушению развития (уродства). Однако эти нарушения, как правило, не наследуются, т.к. не связаны с мутациями (модификации).Влияние рациона матери на эпигенотип. Наш образ жизни может помешать реализации генетических программ развития у детей и внуков. Мы пока далеки от управления эпигенетической информацией. Но того что мы знаем уже достаточно, чтобы понимать как важно не помещать реализации генетической информации - предотвратить те эпигенетические изменения, которые могут быть вызваны нашими вредными привычками. Однако есть и особый тип модификаций, которые могут передаваться через деления клеток и даже сохраняться потомками. Это эпигенетические изменения, т.е. длительно сохраняющиеся изменения экспрессии генов, не связанные с изменениями последовательностей ДНК и РНК. Именно эти механизмы используются для того, чтобы вызвать молчание 90% генов в каждом типе специализированных клеток. Эпигенетические изменения связаны главным образом с процессами метилирования ДНК и гистоновых белков, которое осуществляется специальными ферментами. Главное отличие эпигенетических механизмов регуляции работы генов от других механизмов, которые используются в регуляции развития, заключается в долговременности их действия, что создает впечатление закрепления изменений на уровне генетического кода. Эпигенетические механизмы объясняют многие удивительные феномены. Пример 1. кастовая структура общественных насекомых связана с эпигенетическими механизмами. У пчел матка (царица), нянька и сборщица меда имеют одинаковый генотип, но разный эпигенотип, что связано с характером кормления Пример 2. Холодовое воздействие также может вызвать эпигенетическое замолкание генов в растениях. Растение капусты, которое не яровизировалась 5 лет. Оно не цветет, т.к. активен ген FLC – репрессор цветения. Пример 3. Монозиготные близнецы имеют одинаковый генотип, но у каждого есть своя пуповина и плацента. Микроусловия разные → различие эпигенетических меток (это механизм адаптации к условиям среды).Именно эпигенетическими изменениями объясняют различия между монозиготными близнецами. Практическое значение исследований генетики развития: 1. Управление развитием растений и животных (создание ТО с нужными свойствами) 2. Создание сортов растений и пород животных с ценными аллелями генов (отслеживание их передачи потомству в сложных скрещиваниях). 3. Профилактика заболеваний 4. Диагностика заболеваний 5. Разработка методов генотерапии
23. Трансгенные организмы и технологии по их получению. Объясните, почему с научной точки зрения трансгенные организмы не опаснее «обычных»?
Трансгенный организм — живой организм, в геном которого искусственно введен ген другого организма. Ген вводится в геном хозяина в форме так называемой «генетической конструкции» — последовательности ДНК, несущей участок, кодирующий белок, и регуляторные элементы (промотор, энхансер и пр.), а также в некоторых случаях элементы, обеспечивающие специфическое встраивание в геном (например, т. н. «липкие концы»). Генетическая конструкция может нести несколько генов, часто она представляет собой бактериальную плазмиду или ее фрагмент. Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическая экспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессия нового гена). К настоящему времени уже создано много таких изменённых организмов. Это и бактерии, производящие инсулин, и другие необходимые человеку соединения, и животные, дающие, например, молоко со свойствами грудного женского молока, а также множество растений, которые или устойчивы к каким-то соединениям, например, к гербицидам, или сами вырабатывают какие-то полезные человеку белки, например, вакцины или антитела. Для того чтобы получить трансгенные организмы нужно выполнить несколько последовательных действий. Во-первых, надо создать вектор, то есть самостоятельно реплицирующуюся молекулу ДНК. Термин репликация (от позднелат. replicatio — повторение) обозначает самовоспроизведение нуклеиновых кислот (обычно ДНК, у некоторых вирусов РНК), обеспечивающее точное копирование генетической информации и передачу ее от поколения к поколению. При репликации ДНК нуклеотидная последовательность копируется (целиком или частично) в виде комплементарной последовательности, т.е. последовательности, у которых структуры двух молекул соответствуют в пространстве, благодаря чему возможно образование между ними водородных связей и осуществление межмолекулярных взаимодействий. Вектор способен включать чужеродную ДНК (гены) и переносить ее в клетки, наследственные свойства которых желают изменить. Векторами они названы за способность осуществлять процесс переноса направленно, по желанию экспериментатора. Во-вторых, надо знать, какой ген необходимо встроить в организм, чтобы придать ему желательные свойства, и иметь этот ген. В-третьих, надо разработать методы переноса, чтобы векторная молекула с необходимыми генами проникла в клетки изменяемого организма и встроила в клеточный геном чужеродные гены. И, в-четвертых, необходимо правильное конструирование векторной молекулы, чтобы встроенный ген полноценно экспрессировался в клетке. Существуют различные типы векторов с разными свойствами. Однако обычно их создают на основе ДНК плазмид или вирусов (в том числе бактериофагов). Плазмиды — это кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные размножаться (реплицироваться) в клетке независимо от цикла размножения клетки. «Дикие» плазмиды очень широко распространены в природных бактериальных популяциях и способны передаваться от одной бактериальной клетки к другой в процессе «конью-гации» — аналога полового размножения. Многие плазмиды содержат гены, которые придают содержащим их бактериям некоторые фенотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов и т. д. Наличие в плазмидах таких генов делает их присутствие в бактериальных клетках выгодным и способствует их размножению. Плазмиды стали настоящим подарком для молекулярных биологов, сейчас на их основе созданы многие современные «векторные» системы, используемые в генной инженерии. Если основная бактериальная ДНК имеет длину более 100 тысяч пар оснований, то размеры плазмид составляют всего несколько тысяч пар оснований. Они легко выделяются и очищаются. Большое количество векторов создано на основе бактериофагов. Они позволяют вводить чужеродную ДНК в ДНК-фаг. Причем, вставляемый фрагмент ДНК может быть значительно большего размера, чем при использовании плазмидного вектора. В последнее время вокруг темы трансгенных организмов (ТО) возикло множество споров. С одной стороны, ТО дают массу выгод, с другой – вещь совершенно новая и невозможно абсолютно уверенно сказать, что никаких, даже самых отдаленных плохих последствий не будет. Мифы: 1) Чужеродные гены из ГМ растений могут попадать в клетки человека, вызывая мутации, рак и т.д. у непосредственного поедателя или у его отдаленных потомков. Опровержение: после того, как чужеродный для данного растения ген вставлен, он уже ничем не отличается от остальных генов этого растения. ДНК она и есть ДНК. 2) Трансгенные продукты могут быть токсичны для человека. Опровержение: токсичность трансгенных продуктов для млекопитающих (в том числе – человека) достоверно доказана никогда не была. 3) ГМ-продукты увеличивают риск возникновения аллергий. Опровержение: сам по себе факт генетических манипуляций нисколько не повышает аллергичность. Другое дело, если у человека уже есть аллергия или предрасположенность к аллергии на какой-нибудь белок из одного организма, то у него, естественно, будет аллергическая реакция и на ГМ-продукт, где этот белок есть. Например: люди с аллергией на белок бразильского ореха реагировали и на трансгенную сою, куда был перенесен ген этого белка. Для людей с аллергиями на другие продукты эта трансгенная соя была безвредна. То есть опасность есть, но сильно преувеличенная. Необходима более детальная маркировка ГМ-продуктов. Реальные опасности: 1) Выращивание генетически модифицированных растений, приводит к сильному падению сортового разнообразия. Для генных модификаций берут один-два сорта, с ними и работают. Остальные вымирают за ненадобностью. 2) Другая опасность – зависимость от фирм-производителей. Сейчас в трансгенные растения вставляют дополнительные гены, делающие их семена стерильными. В результате всякий раз нужно покупать семена на фирме.
24. Транспозоны. Какие участки генома к ним относятся, как они функционируют, разновидности, их доля в геноме, положительное и негативное значение. Транспозоны - участки ДНК организмов, способные к передвижению (транспозиции) и размножению в пределах генома. Имеются у бактерий, растений и животных. Они перемещаются с участием комплекса белков, в первую очередь фермента транспозазы, который узнает элемент и обеспечивает его перенос на новое место. Располагаются в хромосомах и иногда переходят в плазмиду. Относятся к нехромосомным генетическим элементам.
|
