ОРГАНИЗАЦИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ

__________________________________________________________________

 

ПОМЕЩЕНИЕ.

 

Первое правило организации культуральных работ – стерильность, и все подходы к организации лаборатории для работы с клеточными культурами проводятся с обязательной оглядкой на это условие.

Как правило, лаборатория культивирования клеток состоит минимум из трех смежных помещений. Это собственно культуральная комната («бокс» или «чистая комната»), предбоксник и лаборатория общего назначения. Кроме того выделяется отдельное помещение подготовки персонала к ежедневной работе.

Культуральная комната (культуральный бокс или «чистая комната») – помещение в котором непосредственно проводятся все манипуляции с клетками. В этом помещении размещается все оборудование, «рабочий» запас реактивов и посуды, необходимых для работы с клеточными культурами. В культуральной комнате создаются и поддерживаются определенные внутренние условия, необходимые для работы с клетками. Одним из таких условий является обеспечение стерильности атмосферы, а также поддержание необходимых температуры и влажности.

Предбоксник (шлюз) – пустое небольшое помещение в котором отсутствует какое либо оборудование, служащее своего рода «буферной» зоной на пути входа в культуральный бокс, дополнительно ограничивающее пространство бокса от окружающей среды при входе и выходе персонала.

Лаборатория общего назначения – помещение, в котором проводятся исследовательские работы, для которых условие стерильности уже не является критичным, а также хранится запас реактивов и культуральной посуды.

Помещение подготовки персонала – зона в которой храниться чистая специальная одежда персонала для работы в боксе, в которой персонал передевается и проходит первичную антисептическую обработку. Очень часто функцию такого помещения выполняет отведенная зона в лаборатории общего назначения.

В идеале организация культуральной лаборатории должна начинаться еще при проектировке здания научно-исследовательской организации. В действительности же, чаще всего, исследователю приходиться подстраивать под свои потребности уже существующие, выделенные под лабораторию помещения. Да и в целом, подход к организации научно-исследовательской культуральной или биотехнологической лаборатории более гибкий, чем подход к организации «чистых помещений» на производстве фармацевтического или биотехнологического профиля. Существуют очень жесткие международные стандарты организации таких помещений на предприятиях, сведенные в так называемых правилах GMP (Good Manufacturing Practice) [ ].

В дальнейшем мы будем рассматривать правила подходы к работе в культуральной лаборатории научно-исследовательского профиля.

 

ОБОРУДОВАНИЕ

 

Ламинарный шкаф (Ламинарный бокс, Ламинар, Laminar-flow box), или боксы абактериальной воздушной среды (БАВ) обеспечивают физическую изоляцию рабочего места от окружающей среды. Технически это достигается путем постоянного равномерного (ламинарного) обдува рабочего места стерильным воздухом. Воздух забирается из окружающей среды или из рабочей камеры ламинара и фильтруется последовательно сначала через фильтры грубой очистки (табл…), а затем, через фильтры тонкой фильтрации – так называемые HEPA-фильтры.

Рис. …. Устройство и принцип работы ламинарного бокса с вертикальной (А) и горизонтальной (Б) подачей очищенного воздуха.

1 – воздухозаборник с фильтром грубой (предварительной) очистки; 2 – вентилятор; 3 – фильтры тонкой (HEPA) очистки; 4 – закрытая рабочая зона; 5 – открытая рабочая зона; 6 – рабочая поверхность.

 

HEPA (англ. High Efficiency Particulate Air или High Efficiency Particulate Absorbing — высокоэффективное удержание частиц) — вид воздушных фильтров тонкой очистки. Фильтры такого типа были изобретены в 40х годах, во время развития ядерного проекта США. Использовались для улавливания радиоактивных частиц на предприятиях ядерной промышленности. Фильтр изготавливается из волокнистого материала, часто из фторопласта (диаметр волокон 0.65-6.5 микрон, расстояние между ними 10-40 микрон), сложенного гармошкой, а также корпуса с элементами, удерживающими лист в сложенном состоянии. Согласно принятой международной классификации существует 5 классов HEPA фильтров: Н10, Н11, Н12, Н13 и Н14. Чем выше класс, тем лучше качество фильтрации воздуха (табл…). Такой фильтр требует замены примерно 1 раз в год (в зависимости от загрязненности помещения). Еще более совершенными по сравнению с НЕРА, являются фильтры UPLA (Ultra Low Penetrating Air).

 

При выборе ламинарного бокса биологической безопасности в первую очередь следует ориентироваться на то, какой тип защиты необходим в планируемой работе (Табл…..), что необходимо защитить – продукт, оператора, окружающую среду, или все вместе.

 

CO₂-Инкубатор. В связи с необходимостью поддержания постоянного рН питательной среды и ее минимального испарения в период инкубации клеток были созданы так называемые углекислотные инкубаторы. Основные конструкции и параметры полностью соответствуют обычным лабораторным термостатам. Основным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды внутри камеры термостата и высокой относительной влажности в ней. Инкубаторы для культивирования клеток должны отвечать определенным требованиям: обеспечивать высокую стабильность заданной температуры, создавать минимальный градиент температуры по полезному объему, иметь систему быстрого восстановления температуры после кратковременного охлаждения. Внутренняя поверхность термостатов должна быть изготовлена из биологически пассивных материалов, т.е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред. Материалы, из которых изготавливают внутренние и наружные части термостата, и покрытия должны выдерживать деконтамиацию водными растворами спирта и стерилизацию УФ-излучением.

В газовой среде камер углекислотного инкубатора повышена концентрация кислорода и углекислого газа, в большинстве случаев только углекислого газа; концентрацию задают в зависимости от условий культивирования и поддерживают автоматически с точностью до ±0,1 %. Наиболее распространены инфракрасные датчики CO₂. Современные модели инкубаторов являются мультигазовыми, т.е. позволяют моделировать газовую среду путем подключения несколько газов одновременно.

 

Оборудование для микроскопии. Для наблюдения за состоянием культивируемых клеток используются специальные перевернутые (инвертированные) микроскопы. Принцип инвертированности заключается в том, что объект наблюдения освещается сверху, а наблюдение ведется через объективы, расположенные под объектом. Это позволяет наблюдать за живыми клетками в культуре, т.е. непосредственно в, сосудах, где происходит процесс их роста. В микроскопах с обычной (прямой) оптической схемой навести фокус на объект исследования (клетки) невозможно из-за толщины культурального сосуда.

Общий вид и оптическая схема инвертированного микроскопа:

1- источник света (обычно галогеновая лампа) с отражателем, 2- светофильтры, 3- диафрагма, 4- конденсор, 5- культуральный сосуд с клетками, 6- рабочий координатный стол, 7- насадка «револьверная» с окулярами, 8-11- направляющая система линз, 12- окуляры, 13- оптическая система вывода изображения на фото\видеокамеру, 14- база микроскопа.