Студопедия — Работа № 7. Иммунохимическое изучение структуры цитоскелета клеток.
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Работа № 7. Иммунохимическое изучение структуры цитоскелета клеток.






Цель работы: Произвести окрашивание флуоресцентными антителами к актину актиновых фибрилл цитоскелета фибробластов с нативным (нормальным) и фрагментированным цитоскелетом.

 

Примечание: моноклональные антитела связанные (коньюгированные) с каким либо флуоресцентным красителем позволяют специфически окрашивать тот или иной структурный элемент клетки. Так FITC-коньюгированные антитела к F-актину (где FITC- флюоросцеин изотиоционат, краситель) позволяют визуализировать актиновые фибриллы в клетке, их ориентацию, локализацию и т.д.

Цитохалазин В – модификатор цитоскелета, препятствует образованию в клетках актиновых фибрилл, вследствии чего клетки частично или полностью теряют возможность двигаться по субстрату.

Протокол работы:

! § Работа с параформальдегидом проводить только под вытяжкой! § Запрещается касаться блока ртутной лампы флуоресцентного микроскопа руками. § Этапы работы 6-8 проводить в темноте или при слабом красном свете.

 

1. Для работы заранее произвести посев клеток вторичной культуры в две культуральные чашки. На 5-е сутки роста культуры оценивают количество и морфологию клеток, особое внимание обращая на фибробласты с морфологией, свидетельствующей об их движении.

2. За сутки до начала окрашивания (4-е сутки культивирования) в одну из чашек внести цитохалазин В (10 мкг на мл среды) и инкубировать 24 часа (370С, 10% СО2).

 

3. Снять чашки с инкубации. Удалить культуральную среду, и залить свежеприготовленным 4% раствор параформальдегидом (в 1х PBS pH 7,0). Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.

4. Удалить р-р параформальдегида из чашки и промыть клетки 1х PBS 2-а раза по 2-3 минуты.

5. Смочить препарат клеток раствором БСА-Tween содержащим 3% БСА (бычий сывороточный альбумин) и 0,02% Tween 20 в 1х PBS. Закрыть герметично чашки и инкубировать 30 минут при 37оС и 95% влажности.

6. Удалить раствор БСА- Tween из чашек и смочить препарат клеток раствором антител (разведенных в растворе БСА- Tween). Закрыть герметично чашки и инкубировать 30 минут при 37оС и 95% влажности.

7. Произвести отмывку препарата от раствора антител в 3 сменах 0,02% Tween 20 на 1х PBS по 5 мин при 37оС плавно покачивая чашки.

8. Заключить препарат в фотозащитную среду (5% N-пропилгаллат и 95% нефлуоресцирующего глицерина) и исследовать под микроскопом соблюдая условия флуоресценции: длина волны возбуждения 480 нм, дихроичное зеркало 505 нм. Эмиссия (спектр свечения) коньюгированных с этим красителем антител сосавляет 535 нм (зеленый цвет).

9. Оценить морфологию клеток нормальных, и культивированных с цитохалазином, изменение локализации актина в клетках обеих групп.

 

 

Нормальные фибробласты После инкубации с цитохалазином

 

Какие флуоресцентные красители кроме FITC могут быть конъюгированы с антителами?

Механизм действия цитохалазина на цитоскелет клетки. Какие модификаторы цитоскелета кроме цитохалазина еще существуют?

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________







Дата добавления: 2015-08-12; просмотров: 447570. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Функция спроса населения на данный товар Функция спроса населения на данный товар: Qd=7-Р. Функция предложения: Qs= -5+2Р,где...

Аальтернативная стоимость. Кривая производственных возможностей В экономике Буридании есть 100 ед. труда с производительностью 4 м ткани или 2 кг мяса...

Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...

Расчетные и графические задания Равновесный объем - это объем, определяемый равенством спроса и предложения...

Основные разделы работы участкового врача-педиатра Ведущей фигурой в организации внебольничной помощи детям является участковый врач-педиатр детской городской поликлиники...

Ученые, внесшие большой вклад в развитие науки биологии Краткая история развития биологии. Чарльз Дарвин (1809 -1882)- основной труд « О происхождении видов путем естественного отбора или Сохранение благоприятствующих пород в борьбе за жизнь»...

Этапы трансляции и их характеристика Трансляция (от лат. translatio — перевод) — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (иРНК...

Образование соседних чисел Фрагмент: Программная задача: показать образование числа 4 и числа 3 друг из друга...

Шрифт зодчего Шрифт зодчего состоит из прописных (заглавных), строчных букв и цифр...

Краткая психологическая характеристика возрастных периодов.Первый критический период развития ребенка — период новорожденности Психоаналитики говорят, что это первая травма, которую переживает ребенок, и она настолько сильна, что вся последую­щая жизнь проходит под знаком этой травмы...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.012 сек.) русская версия | украинская версия