Студопедия — Очистка афтозного вирусного материала с помощью ультразвука
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Очистка афтозного вирусного материала с помощью ультразвука






Эффективность электронно-микроскопических исследований материалов в диагностических целях, приготовленных из афт больных животных, возрастает при наличии вируссодержащих препаратов с достаточно высокой степенью очистки от балластных белков. При решении данной проблемы для получения очищенных препаратов из минимальных количеств афтозного вирусного материалов, взятых от больных животных, использовали ультразвуковой дезинтегратор (1-2 г афт)

 

Ультразвуковой диспергатор

.

Для приготовления 10% суспензии афтозного вируса стенки афт отмывали физиологическим раствором рН 7,4-7,6, высушивали фильтровальной бумагой, взвешивали, измельчали и затем растирали в ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы. К афтозному материалу добавляли буферный раствор в соотношении 1:10 и суспензию, после экстрагирования при комнатной температуре в течение 2 часов, замораживали.

После размораживания для дополнительной дезинтеграции тканевых агрегатов и вирусных частиц суспензию подвергали ультразвуковой обработке. Стакан с суспензией помещали в чашку со льдом и ставили на подъёмный столик ультразвукового дезинтегратора типа MSE 500 c частотой 20 000 Гц. Гидравлическим подъёмником столик поднимали до соприкосновения вибратора с поверхностью обрабатываемой жидкости. Озвучивание проводили в состоянии резонанса при интенсивности 80-100 вт/см2 в течение 20-30 сек. Затем к суспензии добавляли 5 мл хлороформа и повторяли обработку при тех же параметрах.

В результате обработки ультразвуком смеси суспензия – хлороформ получали гомогенную эмульсию, которую затем центрифугировали при 2 000 g в течение 15 мин. Эмульсия разделялась на две фазы: надосадочную водную, содержащую вирус, и осадок белка, денатурированного хлороформом.

Водную фазу, представляющую собой очищенную вирусную суспензию, отбирали в стерильную посуду и использовали для приготовления препаратов для электронной микроскопии. В условиях негативного контрастирования вирусных препаратов 2% раствором ФВК рН 6,8 в поле зрения электронного микроскопа наблюдали однородные по форме и размерам вирусные частицы. Микрофотографии и гистограмма распределения размеров афтозного вируса ящура А22 представлены на рис. 3.5. Из гистограммы следует, что при среднем диаметре равным 28,6 + 0,5 нм размеры вирионов варьируют в пределах от 25 до 33 нм.

Вирионы афтозного вируса типа О имеют средний диаметр 29,9 + 0,6 нмс вариацией размеров вирионо в пределах от 23 до 33 нм. Замер диаметра проводили не менее чем у 100 частиц.

В отдельных препаратах, приготовленных из свежеполученных афт КРС, одновременно наблюдали от 5 до 20 вирионов. Для подтверждения факта присутствия именно вирионов вируса ящура последние обрабатывали раствором ФВК с кислым значением рН. Если при контрастировании вирусных препаратов 2% раствором ФВК рН 6,0 вирусные частицы не выявлялись, давалось предварительное заключение о выявлении вирионов вируса ящура. Дополнительные сведения по идентификации вируса получали с использованием иммунной электронной микроскопии по общепринятой методике.

Основой всех методических приемов техники иммунной электронной микроскопии (ИЭМ) является смешивание вирусной суспензии с гомологичной антисывороткой, приводящее к формированию иммунных комплексов, легко выявляемых в электронно-микроскопических препаратах [Королев М.Б,1980]. Характерные комплексы из вирионов афтозного вируса ящура А22 приведены на рис. 3.5б.

К достоинствам данного метода очистки относится то, что интенсивная кратковременная ультразвуковая обработка создает оптимальные условия для экстрагирования вирусных частиц из измельченной ткани. При обработке вирусной суспензии в смеси с хлороформом образуется гомогенная мелкодисперсная эмульсия с огромной поверхностью органической фазы, что приводит к более полной избирательной денатурации балластных белков.

Кроме того, ультразвуковые волны сообщают частицам высокую кинетическую энергию, в результате чего наблюдается интенсивная коагуляция денатурированного белка, который затем легко удаляется при центрифугировании. При использовании в работе афтозного материала хранившегося продолжительное время в 50%-ном глицерине (до 2 лет) было достаточно проведения однократной очистки при помощи ультразвука. Для суспензий, приготовленных из свежих от крупного рогатого скота, необходима двукратная очистка этим способом [Пономарев А.П. и др., 1978].

Таким образом, очистка вирусной суспензии с применением ультразвука обеспечивает дополнительное экстрагирование вирусных частиц из тканевых частиц, значительно сокращает время и дает возможность качественно очищать минимальные объёмы вирусной суспензии (10-20 мл).







Дата добавления: 2015-09-04; просмотров: 521. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Практические расчеты на срез и смятие При изучении темы обратите внимание на основные расчетные предпосылки и условности расчета...

Функция спроса населения на данный товар Функция спроса населения на данный товар: Qd=7-Р. Функция предложения: Qs= -5+2Р,где...

Аальтернативная стоимость. Кривая производственных возможностей В экономике Буридании есть 100 ед. труда с производительностью 4 м ткани или 2 кг мяса...

Вычисление основной дактилоскопической формулы Вычислением основной дактоформулы обычно занимается следователь. Для этого все десять пальцев разбиваются на пять пар...

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИЗНОС ДЕТАЛЕЙ, И МЕТОДЫ СНИЖЕНИИ СКОРОСТИ ИЗНАШИВАНИЯ Кроме названных причин разрушений и износов, знание которых можно использовать в системе технического обслуживания и ремонта машин для повышения их долговечности, немаловажное значение имеют знания о причинах разрушения деталей в результате старения...

Различие эмпиризма и рационализма Родоначальником эмпиризма стал английский философ Ф. Бэкон. Основной тезис эмпиризма гласит: в разуме нет ничего такого...

Индекс гингивита (PMA) (Schour, Massler, 1948) Для оценки тяжести гингивита (а в последующем и ре­гистрации динамики процесса) используют папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (РМА)...

Типовые примеры и методы их решения. Пример 2.5.1. На вклад начисляются сложные проценты: а) ежегодно; б) ежеквартально; в) ежемесячно Пример 2.5.1. На вклад начисляются сложные проценты: а) ежегодно; б) ежеквартально; в) ежемесячно. Какова должна быть годовая номинальная процентная ставка...

Выработка навыка зеркального письма (динамический стереотип) Цель работы: Проследить особенности образования любого навыка (динамического стереотипа) на примере выработки навыка зеркального письма...

Словарная работа в детском саду Словарная работа в детском саду — это планомерное расширение активного словаря детей за счет незнакомых или трудных слов, которое идет одновременно с ознакомлением с окружающей действительностью, воспитанием правильного отношения к окружающему...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.009 сек.) русская версия | украинская версия