Исследование параметров гуморального иммунитета

Определение общего белка и иммуноглобулинов в сыворотке крови

Для определения общего белка в сыворотке крови позвоночных и гемолимфе беспозвоночных используют рефрактометрические (по показателю преломления), спектрофотометрические, колориметрические (биуретовый, метод Лоури, Брэдфорда и др.). В полевых условиях можно использовать портативный рефрактометр, в условиях лаборатории выбор метода зависит от требуемой точности. При определении белковых фракций (альбумины, α-, β- и γ-глобулины) сыворотки крови используют электрофоретические (в полиакриламидном геле, на бумаге, на ацетате целлюлозы), турбидиметрические (высаливание нейтральными солями), седиментационные (ультрацентрифугирование) методы.

Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови по реакции с натрия сульфитом.

При взаимодействии иммунных глобулинов сыворотки крови с 18%-ным раствором натрия сульфита изменяется структура белковых молекул, и раствор мутнеет с интенсивностью, пропорциональной концентрации иммуноглобулинов.

В две пробирки вносят по 3,8 мл 18%-ного раствора натрия сульфита и добавляют по 0,1 мл сыворотки крови, смешивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре, затем измеряют оптическую плотность смеси при длине волны 400±5 нм против 18%-ного раствора натрия сульфита. Расчет ведут по калибровочной кривой, построенной с использованием сыворотки крови с известным содержанием иммуноглобулинов, либо с использованием табличных данных.

Метод используют в основном для определения иммуноглобулинов у новорожденных животных и в молоке (молозиве).

Определение отдельных классов иммуноглобулинов

Уровень сывороточных иммуноглобулинов отражает функциональное состояние В-системы иммунитета. Принцип определения содержания иммуноглобулинов основан на взаимодействии их с антителами, полученными против них (т. е. на реакции антиген-антитело, где в роли антигена выступают определяемые иммуноглобулины).

Для определения концентрации сывороточных иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA используют антисыворотки к тяжелым цепям иммуноглобулинов разных классов. Основными способами обнаружения иммуноглобулинов разных классов являются реакция преципитации (в жидкой среде), иммунодиффузии (в геле) или нефелометрия и турбидиметрия, выявляющие взаимодействие иммуноглобулина с антителами по светорассеянию или мутности.

Методы иммунодиффузии в геле. Метод радиальной иммунодиффузии был предложен Манчини (Manchini и др., 1964) и получил наиболее широкое из всех методов распространение в клинике благодаря простоте и надежности. На гладкую поверхность равномерно наносят гель агара, агарозы или полиакриламида, содержащий антитела к иммуноглобулинам определяемого класса. В затвердевшем геле вырезают лунки, которые заполняют исследуемой биологической жидкостью. Молекулы антигена (в данном случае определяемых иммуноглобулинов) радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. Площадь образующегося преципитата прямо пропорциональна концентрации иммуноглобулинов в исследуемой жидкости. Для завершения диффузии lgA и lgG требуется обычно 2 сут, lgM – 5-7 сут. Учет реакции ведут обычно без окрашивания преципитатов. Слабые преципитаты становятся лучше различимы после обработки танином или раствором уксусной кислоты. Иногда преципитаты окрашивают красками для белков (амидочерным, кумасси синим, бромфенолом синим и др.), предварительно удалив все белки, не принявшие участия в образовании преципитата, промывкой гипертоническим раствором NaCI.

Методы иммунодиффузии довольно чувствительны (видимые преципитаты образуются при концентрации белка свыше 5 мг/л), их ошибка составляет не более 10%. Основным недостатком этих методов является длительное время анализа (1-2 сут). Сократить это время до 3-18 ч позволяет использование электрического поля – метод иммуноэлектрофореза в геле, в частности ракетного иммуноэлектрофореза. Суть метода состоит в том, что гель агарозы, содержащий моноспецифическую антисыворотку, равномерно распределяют по гладкой поверхности. Вырезанные лунки заполняют исследуемой жидкостью. В электрическом поле молекулы антигена мигрируют в гель и, взаимодействуя с антителами, образуют преципитаты, вытянутые в сторону анода. Длина полосы такого преципитата в стандартных условиях пропорциональна концентрации антигена в исследуемой жидкости.

Турбидиметрический метод. Метод основан на измерении ослабления интенсивности светового потока, прошедшего через раствор, содержащий твердые частицы, вследствие поглощения и рассеяния светового потока. Суть метода состоит в том, что исследуемую биологическую жидкость, содержащую антиген (определяемых иммуноглобулин), смешивают с буферным реагентом, содержащим моноспецифические антитела. В результате инкубации образуются иммунные комплексы, способные рассеивать проходящий свет. Концентрацию определяемого иммуноглобулина находят по калибровочной кривой, построенной по результатам измерения оптической плотности смесей реагента и растворов с известным содержанием иммуноглобулинов разных классов.